石 剛，王靜梅＊，剡根強(qiáng)，李永剛

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆西部牧業(yè)股份有限公司，新疆石河子832000）

牛支原體（Mycoplasma bovis）作為感染牛的一種重要的致病性支原體，其致病力僅次于絲狀支原體絲狀亞種［1］。目前有研究證實(shí)，牛支原體除可導(dǎo)致?tīng)倥７窝住㈥P(guān)節(jié)炎、奶牛乳腺炎外還可引起角膜結(jié)膜炎、中耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種疾?。?］。該病在世界范圍內(nèi)存在，該病原體于1961年首次在美國(guó)患有乳房炎的病牛中分離出來(lái)，目前在歐洲和北美洲流行并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］，在我國(guó)，黎濟(jì)申1983年首次報(bào)道從患有乳腺炎的牛乳中分離到牛支原體，以后只有零星臨床報(bào)道［4］。自2008年以來(lái)我國(guó)部分地區(qū)暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的“牛支原體肺炎”疫情，石磊、冉智光、姚永進(jìn)等人相繼報(bào)道于患病肉牛及奶牛體內(nèi)分離并鑒定得到牛支原體［5-7］，牛發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8］。疫苗是有效預(yù)防該病的重要手段之一，但目前除了美國(guó)以外，幾乎沒(méi)有商品化疫苗用于預(yù)防牛支原體感染。美國(guó)雖有兩種商品化疫苗，但疫苗的有效性還沒(méi)有發(fā)表公開(kāi)的證據(jù)確認(rèn)［9］。篩選生長(zhǎng)快、滴度高的培養(yǎng)基是滅活疫苗生產(chǎn)工藝研究中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前用于牛支原體分離培養(yǎng)常用的牛心湯培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，培養(yǎng)成本高，培養(yǎng)效率低，不利于牛支原體的大量培養(yǎng)。本試驗(yàn)對(duì)常用牛心湯培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，并對(duì)改良后的培養(yǎng)基的增菌效果進(jìn)行了測(cè)定，為牛支原體的大量培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 牛支原體新疆分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。

1.1.2 設(shè)備 Power Wave XS2連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，NanoDrop 2 000超微量紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛心湯培養(yǎng)基：10g／L 水解乳蛋白Hank’s液（500 mL／L），牛心湯（250 mL／L），500g／L 葡萄糖（20 mL／L），2g／L 小牛DNA（10 mL／L），200mg／mL氨芐青霉素（5mL／L），醋酸鉈（5mL／L，初次分離時(shí)適用），4g／L酚紅（2mL／L），250mL／L酵母浸出汁（10mL／L），滅活新生牛血清（200mL／L），pH 調(diào)至7.4～7.6。

改良培養(yǎng)基A：10g／L 水解乳蛋白Hank’s液（500mL／L），2倍濃縮牛心湯（150mL／L），500g／L葡萄糖（20 mL／L），2g／L 小牛DNA（10mL／L），200 mg／mL氨芐青霉素（5 mL／L），醋酸鉈（5 mL／L，初次分離時(shí)適用），4g／L酚紅（2 mL／L），250mL／L酵母浸出汁（10mL／L），滅活新生牛血清（200mL／L），牛肺消化液（100 mL／L），pH調(diào)至7.4～7.6。

改良培養(yǎng)基B：10g／L 水解乳蛋白Hank’s液（400mL／L），DMEM（100mL／L），2倍濃縮牛心湯（150mL／L），500g／L葡萄糖（20mL／L），2g／L 小牛DNA（10 mL／L），200 mg／mL氨芐青霉素（5 mL／L），醋酸鉈（5mL／L，初次分離時(shí)適用），4g／L酚紅（2mL／L），250mL／L酵母浸出汁（10mL／L），滅活新生牛血清（200 mL／L），牛肺消化液（100 mL／L），pH 調(diào)至7.4～7.6。

1.2 方法

1.2.1 菌種的復(fù)蘇將在-72℃凍存的牛支原體新疆分離株種子移入10mL 牛心湯培養(yǎng)基中復(fù)蘇，復(fù)蘇后按照5%傳代約3～5代，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后按照培養(yǎng)量的5%分別接種到三種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種3瓶，作為待測(cè)菌液置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為8%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔24h取樣待測(cè)。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù) 每間隔24h 從待測(cè)菌液中取樣，采用活菌梯度稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3份，將試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以未接種菌液的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。連續(xù)計(jì)數(shù)4d，每天觀察試管顏色變化，直至無(wú)試管顏色發(fā)生變化為止，最后一個(gè)變色的試管即為待測(cè)菌液的生長(zhǎng)滴度，用顏色變化單位（color change unit，ccu）表示。用3份樣品的平均滴度（n＝3）表示該時(shí)間點(diǎn)支原體平均最大生長(zhǎng)滴度。

1.2.3 菌體蛋白測(cè)定 每間隔24h從待測(cè)菌液中取樣，經(jīng)16 000r／min離心15min，后用pH7.2的PBS緩沖液洗滌2次～3次，制成菌懸濁液，取2μL利用Nano Drop 2 000超微量紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其菌體蛋白量，每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。

1.2.4 OD值的測(cè)定 每間隔24h從待測(cè)菌液中取樣，經(jīng)16 000r／min離心15min，后用pH 7.2的PBS緩沖液洗滌2次～3次，制成菌懸濁液，取100 μL加入酶標(biāo)板中，利用Power Wave XS2連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在630nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。

2 結(jié)果

2.1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

在培養(yǎng)24、48、72、96h，牛支原體新疆分離株在普通牛心湯培養(yǎng)基中的平均生長(zhǎng)滴度為1.0×102、4.0×103、4.0×105、1.0×106ccu／mL；在改良培養(yǎng)基A 中的平均生長(zhǎng)滴度為1.0×106、4.0×107、1.0×109、1.0×109ccu／mL；在改良培養(yǎng)基B中的平均生長(zhǎng)滴度為7.0×106、4.0×108、1.0×1010、1.0×1010ccu／mL；陰性對(duì)照未變色。結(jié)果表明：牛支原體新疆分離株在改良培養(yǎng)基A 和B中培養(yǎng)72h即達(dá)到最大平均生長(zhǎng)滴度，而在普通牛心湯培養(yǎng)基中則需要96h，在改良培養(yǎng)基B 中的最大生長(zhǎng)滴度可達(dá)到1.0×1010ccu／mL。

以采樣點(diǎn)時(shí)間為橫坐標(biāo)，平均生長(zhǎng)滴度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，分別將牛支原體新疆分離株在3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)滴度繪制成曲線（圖1）。

圖1 牛支原體新疆分離株在3種培養(yǎng)基中不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)滴度Fig.1 The growth titers of Xinjiang isolated strain in the three improved media

2.2 菌體蛋白測(cè)定結(jié)果

在3種培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72、96h后采樣測(cè)定菌體蛋白量：牛支原體新疆分離株在改良培養(yǎng)基B中的菌體蛋白量最大，改良培養(yǎng)基A 次之，但均比普通牛心湯培養(yǎng)基中的菌體蛋白量高，表明改良培養(yǎng)基B 的培養(yǎng)效率最高，較其他兩種培養(yǎng)基更適合用于牛支原體的大量培養(yǎng)（表1）。

表1 牛支原體新疆分離株在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間菌體蛋白量Table 1 The bacterial protein of Xinjiang isolated strain in the three improved media

2.3 OD值測(cè)定結(jié)果

在3種培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72、96h后采樣測(cè)定菌懸液OD值：牛支原體新疆分離株在改良培養(yǎng)基②中測(cè)得的OD值最大，改良培養(yǎng)基A 次之，普通牛心湯培養(yǎng)基中的OD值最小，這與菌體蛋白量的測(cè)定結(jié)果相符合，說(shuō)明改良培養(yǎng)基B 的培養(yǎng)效果最佳（表2）。

表2 牛支原體新疆分離株在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間OD值測(cè)定Table 2 The OD value of Xinjiang isolated strain in the three improved media

3 討論

細(xì)菌計(jì)數(shù)一般采用細(xì)菌的平皿活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，cfu），但由于牛支原體生長(zhǎng)緩慢，在固體培養(yǎng)基上形成可觀察到的菌落所需時(shí)間甚長(zhǎng)，在實(shí)際試驗(yàn)中難以奏效，因此常采用10倍倍比稀釋的方法計(jì)數(shù)牛支原體的活菌數(shù)量，以顏色變化單位（ccu）表示。但ccu只能代表活菌的數(shù)量級(jí)，而不表示活菌的具體個(gè)數(shù)。

牛支原體基因組大小只有典型細(xì)菌的20%～40%，攜帶的信息量和生物合成能力有限，因此，需要通過(guò)宿主細(xì)胞提供其生存所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。牛支原體體外生長(zhǎng)培養(yǎng)要求很高，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也比一般細(xì)菌的高［10］。因此，研究探索培養(yǎng)成本低培養(yǎng)效率高且培養(yǎng)時(shí)間短的培養(yǎng)基對(duì)牛支原體的大量培養(yǎng)至關(guān)重要。目前實(shí)驗(yàn)室常用的牛心湯培養(yǎng)基能夠?yàn)榕Ｖгw的生長(zhǎng)提供所需要的膽固醇、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是也存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、培養(yǎng)效率低等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)在此培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定的改良，并對(duì)牛支原體新疆分離株在改良后的培養(yǎng)基中的增菌效果進(jìn)行了測(cè)定，分別采用活菌計(jì)數(shù)、菌體蛋白量測(cè)定、OD值測(cè)定3種方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，牛支原體新疆分離株在改良后的牛心湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快，滴度高，有助于滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中菌體的大量培養(yǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果也僅是實(shí)驗(yàn)室階段小量培養(yǎng)得到的數(shù)據(jù)，在進(jìn)行中試規(guī)模或生產(chǎn)規(guī)模的牛支原體培養(yǎng)或發(fā)酵罐生產(chǎn)時(shí)可作為一定的參考，但擴(kuò)大規(guī)模后尚需要進(jìn)一步進(jìn)行有關(guān)工藝條件和營(yíng)養(yǎng)成分改良的研究。

另外，從培養(yǎng)基材料上分析，新生牛血清為主要的營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)源，也是造成培養(yǎng)基成本高的主要原因，目前尚無(wú)替代材料；感染牛支原體主要引起以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎病例［11］，推測(cè)牛支原體在牛肺臟中能夠快速大量繁殖，因此，本試驗(yàn)改良配方中加入了牛肺消化液；牛心湯由實(shí)驗(yàn)室自制并進(jìn)行了2倍濃縮以提高營(yíng)養(yǎng)成分，由于牛心湯目前尚未見(jiàn)商品，常由實(shí)驗(yàn)室從屠宰場(chǎng)購(gòu)置牛心臟后自制，除了存在生物材料污染的風(fēng)險(xiǎn)外，也沒(méi)有相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可借鑒。

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