李 杰，李前瑞，田婷婷，許君艷，姚運亮，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

羊口瘡（又稱羊傳染性膿皰）存在于大部分養(yǎng)羊國家［1］。該病多發(fā)于4月齡～6月齡羔羊，發(fā)病羔羊因口唇潰爛而采食困難，嚴重影響羔羊生長發(fā)育，甚至引起繼發(fā)性感染，病死率可達到20%～50%［1-2］。隨著近年來我國養(yǎng)羊數(shù)量的迅速增加，羊口瘡疫情越來越多，給養(yǎng)羊戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失。環(huán)境中羊口瘡病毒或者帶毒成年羊均是本病發(fā)生的傳染源，因而準確快速的羊口瘡病毒檢測技術(shù)對羊口瘡疫情監(jiān)測至關(guān)重要。目前常用的羊口瘡血清學(xué)檢測方法包括ELISA、瓊脂雙擴散試驗、免疫熒光技術(shù)等［3-4］，其中ELISA方法具有操作簡便、敏感性和特異性強等優(yōu)點。但已有的羊口瘡ELISA檢測方法中均使用完整的病毒粒子做為包被抗原［5］，存在包被抗原制備繁瑣困難，以及感染操作人員和污染環(huán)境等風(fēng)險，因而有必要對其進行改良。

羊口瘡病毒基因組中存在B2L和VIR兩種主要保守性基因。B2L基因是結(jié)構(gòu)基因，其編碼的蛋白是羊口瘡病毒的保護性抗原之一［6-7］。VIR基因即干擾素抑制基因，可抑制干擾素的抗病毒活性［8-9］。不同分離株VIR基因編碼的氨基酸序列相似性為92%～94%［10］，B2L基因編碼氨基酸序列的相似性為97.1%～98.7%［11］，這兩種蛋白都可刺激機體產(chǎn)生高效價的抗體［9，12］。據(jù)此，可以選擇這兩種蛋白作為包被抗原［13］，用以測定機體羊口瘡病毒抗體的ELISA效價。

本研究以羊口瘡病毒細胞毒DNA基因組為模板，擴增B2L和VIR基因，通過原核表達系統(tǒng)獲得其原核表達蛋白，對重組蛋白的抗原性進行鑒定，所獲得結(jié)果為改良羊口瘡ELISA診斷方法提供有價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、載體和宿主細胞 原核克隆載體pGEM-Teasy購自Promega公司；羊口瘡細胞毒、表達載體PET-32a、菌株DH5α、BL21（DE3）由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2 試驗用動物 成年健康雌性家兔（中國白兔），2.0kg±0.35kg，購自楊凌家兔養(yǎng)殖戶。

1.1.3 主要試劑 TaKaRa Ex-Taq DNA ploymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、蛋白分子量標準、DNA標準DL 2 000，購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans5kMarker、Blue Plus II Protein Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增 根據(jù)GenBank公布的羊口瘡病毒B2L和VIR DNA序列（分別為JN565696.1和JN565697.1）設(shè)計引物，B2L上游引物：5′-CGCCGCGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCA-3′（引入BamHⅠ酶 切 位 點）；下 游 引 物：5′-CCCCCCAAGCTTTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCCG-3′（引入HindⅢ酶切位點）；VIR上游引物：5′-CGCCGCGGATCCATGGCCTGCGAGTGCGCGTCTCTGAT-3′（引入BamHⅠ酶切位點）；下游引物：5′-CCCCCCAAGCTTTTAGAAGCTGATGCCGCAGTTGTTGA-3′（引入HindⅢ酶切位點）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。取牛睪丸原代細胞增毒獲得的第6代羊口瘡病毒細胞培養(yǎng)液100μL在沸水中水浴5min，冷水中冷卻3min，1 000r／min離心5min，取上清為模板，用PCR擴增目的片段。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃50s，56℃30s，72℃90 s，共35個循環(huán)；最后72℃10min。取全部PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，然后按照DNA膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定 將DNA膠回收產(chǎn)物與pET-32a用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)中，從含有氨芐青霉素的平板中挑取單克隆用質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，陽性克隆測序。

1.2.3 基因的誘導(dǎo)表達和鎳柱純化 表達菌在不同溫度、不同IPTG濃度、不同時間取樣，樣品在4℃以12 000r／min離心2min后收集菌體，PBS洗滌3次，然后用1／10倍體積的PBS重懸，冰上超聲破碎菌體（200W，每次超聲1min，間隔2s），超聲3min～5 min，4℃、12 000r／min離心2min分離上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳確定最佳表達條件。

按最佳表達條件大量誘導(dǎo)菌體，經(jīng)洗滌和超聲破碎菌體后4℃離心，取上清用鎳柱純化，經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定。

1.2.4 抗血清制備 取3只家兔，免疫前每只采血3mL，分離血清作為陰性對照血清。分別在家兔脊柱兩側(cè)、腹股溝經(jīng)皮內(nèi)或皮下接種滅活羊口瘡病毒抗原，接種劑量為1mg／只。每隔2周接種1次，共4次。第1次免疫接種所用病毒抗原與弗氏完全佐劑等體積完全混勻，第2次則與弗氏不完全佐劑混勻，第3次及以后免疫接種使用的均為水劑抗原。第4次免疫接種后的第10天經(jīng)心臟采集兔血，分離血清，制備的抗血清即為兔抗羊口瘡病毒抗血清?？寡灞鶅霰４妫￤estern blot和ELISA檢測用。

1.2.5 蛋白抗原性鑒定

1.2.5.1 Western blot鑒定 純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50g／L脫脂奶粉室溫封閉2h；用PBST漂洗PVDF膜3次，每次10min，加入封閉液稀釋的兔抗羊口瘡病毒抗血清（1∶400稀釋），4℃孵育過夜；PBST 漂洗PVDF膜3次，每次10min，加入PBST稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育1h；ddH2O漂洗，加入增強型HRP-DAB底物顯色，室溫作用約30min，顯色拍照。

1.2.5.2 ELISA鑒定 將純化的B2L蛋白、VIR蛋白、羊口瘡病毒按最佳包被濃度分別包被在96孔酶標板上，檢測山羊血清53頭份，新生羔羊臍帶血為陰性對照，加HRP標記兔抗羊二抗，經(jīng)TMB底物顯色15min后，酶標儀讀取OD 450nm值。結(jié)果以待檢血清OD 450nm值／陰性血清OD 450nm值≥2.1判為陽性，否則判為陰性，計算不同抗原檢測的陽性率并進行比較。

2 結(jié)果

2.1 B2L、VIR基因PCR擴增

分別用引物擴增羊口瘡病毒B2L和VIR基因，PCR擴增后B2L基因在1 100bp、VIR基因在500 bp左右有一特異性條帶，與B2L基因目的片段大小1 137bp和VIR基因目的片段大小552bp基本相符（圖1）。

圖1 PCR擴增B2L和VIR基因Fig.1 PCR amplication of B2Land VIR genes

2.2 重組質(zhì)粒鑒定與測序

2.2.1 重組表達質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果 挑取單克隆，經(jīng)過夜培養(yǎng)獲得的菌液進行質(zhì)粒提取，以重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得與目的片段大小相符的特異性條帶，證明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 pET32a-B2L和pET32a-VIR重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant pET32a-B2Land pET32a-VIR plasmids

2.2.2 重組表達質(zhì)粒酶切鑒定 PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，由于B2L和VIR基因引物中加有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到兩個片段，一個與pET-32a載體片段大小一致，另一個與目的片段大小一致（圖3）。

圖3 pET32a-B2L和pET32a-VIR重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant pET32a-B2Land pET32a-VIR plasmids by double enzyme digestion

2.2.3 序列分析 酶切鑒定為陽性的菌液送樣測序，測序結(jié)果用DNA Star軟件整理后進行Blast比對，比對結(jié)果顯示重組質(zhì)粒與設(shè)計一致，表明目的基因已成功連接到pET-32a表達載體上。

2.3 基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

對不同誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度下誘導(dǎo)后的菌液進行超聲破碎、離心后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，未誘導(dǎo)的菌液作為對照。結(jié)果可見pET32a-B2L-BL21在60ku左右有一條特異性條帶，與目的片段62.1ku大小基本相符，且B2L上清在10℃、IPTG濃度為0.3mmol／L、4h表達量最高（圖4）；pET32a-VIR-BL21在29.0ku～44.3ku之間有一特異性條帶，大小在40ku左右，與目的片段39.7ku大小基本相符，上清在37℃、IPTG濃度為1mmol／L、11h表達量最高（圖5）。

圖4 重組pET32a-B2L-BL21上清最佳表達條件的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE analysis of supernatant in the best expression of recombinant pET32a-B2L-BL21

圖5 重組pET32a-VIR-BL21上清最佳表達條件的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of supernatant in the best expression of pET32a-VIR-BL21

2.4 蛋白純化

重 組 pET32a-B2L-BL21、pET32a-VIR-BL21菌液表達的上清用鎳柱純化，其產(chǎn)物進行SDSPAGE電泳（圖6、圖7）。結(jié)果可見B2L、VIR蛋白純化后都有目的條帶，且分子質(zhì)量與目的片段大小相符，說明pET32a-B2L-BL21、pET32a-VIR-BL21在上清中表達了目的蛋白。

圖6 B2L蛋白純化的SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified B2Lprotein

2.5 抗原性鑒定

2.5.1 Western blot鑒定 用兔抗羊口瘡病毒抗血清對純化的蛋白進行Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)特異條帶與預(yù)期蛋白大小相符（圖8、圖9），說明表達的蛋白為目的蛋白，而且能與兔抗羊口瘡病毒抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明表達的蛋白與羊口瘡病毒擁有共同的B細胞表位。

圖7 VIR蛋白純化的SDS-PAGE電泳Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified VIR protein

圖8 VIR純化蛋白的Western blot鑒定Fig.8 Identification of purified VIR protein by Western blot

圖9 B2L純化蛋白的Western blot鑒定Fig.9 Identification of purified B2Lprotein by Western blot

2.5.2 ELISA鑒定 B2L蛋白、VIR蛋白和羊口瘡病毒分別作為包被抗原，檢測山羊血清53頭份，經(jīng)計算表明B2L蛋白和羊口瘡病毒檢測的陽性率相同，都為56.6%；VIR蛋白檢測的陽性率為52.83%（表1），說明B2L蛋白具有與全病毒相近的診斷敏感性和特異性。

表1 不同抗原檢測山羊血清的結(jié)果Table 1 The result of different antigens detecting goat sera

3 討論

羊口瘡病毒B2L和VIR蛋白都可刺激機體產(chǎn)生高效價抗體，感染羊口瘡病毒后不僅患病動物體內(nèi)存在抗B2L、VIR蛋白的抗體，而且未發(fā)病的隱性感染的山羊體內(nèi)也存在該抗體。目前我國在山羊養(yǎng)殖中不進行羊口瘡疫苗免疫接種，所以只要動物被羊口瘡病毒感染，機體內(nèi)就能檢測出抗B2L和VIR蛋白的抗體，可作為羊口瘡的診斷指標。

目前國內(nèi)外對B2L和VIR基因表達方面的研究較少。趙魁等［14］對羊口瘡病毒長春分離株的B2L基因成功進行了真核表達，但真核表達系統(tǒng)具有目的蛋白的表達水平低、費用高、操作復(fù)雜、周期長等缺點；張海瑞等對B2L基因進行了原核表達，但是是在包涵體中表達的目的蛋白［15］，還沒有B2L基因可溶性表達的報道；目前只有對VIR基因進行克隆和進化關(guān)系的研究，還沒有對VIR蛋白表達方面的報道。由于作為ELISA檢測的包被抗原需要有活性，才能與天然蛋白的空間構(gòu)象相一致，以便更好的進行檢測，防止假陽性的出現(xiàn)，因而需要進行蛋白的可溶性表達。本研究采用將目的蛋白與pET-32a載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)中，通過不斷尋找最佳表達條件使目的蛋白在BL21（DE3）中高效、可溶性表達。從表達情況可知pET32a-B2L-BL21上清在10℃、IPTG濃度為0.3 mmol／L、4h表達量最高；pET32a-VIR-BL21上清在37℃、IPTG濃度為1mmol／L、11h表達量最高。本研究通過Western blot和ELISA方法鑒定出獲得的B2L和VIR原核表達蛋白能與兔抗羊口瘡病毒抗血清特異性結(jié)合，而且B2L蛋白檢測53頭份血清的陽性率與羊口瘡病毒檢測的結(jié)果相同，證明其具有與羊口瘡病毒相同的B細胞表位，可以代替羊口瘡病毒作為包被抗原，這為羊口瘡ELISA檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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