孫子龍，牛瑞燕，邊升太，王志強，張建海，王金明，王俊東＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學山西省重點實驗室，山西太谷030801；2.大同市新榮區(qū)薪源種羊場，山西大同037002）

精子中的精蛋白和DNA 從被發(fā)現(xiàn)并分離出來到現(xiàn)在已經(jīng)有100多年的歷史。在精子細胞階段，核內(nèi)堿性蛋白質(zhì)經(jīng)歷了由組蛋白（histones，H1，H2A，H2B，H3 和H4）-過渡蛋白（transition proteins，TPs，如TP1，TP2，TP3等）-精蛋白（protamine，P）的轉換過程，這個過程稱為組蛋白-精蛋白取代反應（histone-to-protamine replacement reaction，HPRR），人類大約有85%的組蛋白被精蛋白替代，通過HPRR，精子細胞核由圓形變?yōu)殚L形，核高度濃縮，形成長形精子細胞，進入附睪后進一步成熟，形成成熟的精子。精蛋白異常就會干擾HPRR，進而影響精子的正常發(fā)生、發(fā)育，造成異常染色質(zhì)形成，使精子的受精能力喪失或下降，最終導致不育［1-2］。

1 精蛋白概述

精蛋白又稱魚精蛋白，分子質(zhì)量約為4ku～7 ku，是在晚期精子細胞中出現(xiàn)的一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白質(zhì)，帶有大量的正電荷，與帶有負電荷的父本DNA 緊密結合形成濃縮的染色質(zhì)。另外，蛋白分子內(nèi)及分子間通過半胱氨酸形成二硫鍵，使得精子細胞由圓形變?yōu)殚L形，染色質(zhì)包裹的更加緊密。精子基因在這種精子特有堿性蛋白保護下處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，從而暫時失去DNA 的轉錄與RNA 的合成，而這也正是成熟精子的特征［3-4］。

已知在哺乳動物有兩種類型的精蛋白，即P1和P2家族，P1 存在于所有的哺乳動物，P2 家族包括P2、P3、P4，它們僅存在于某些哺乳動物，如人類、小鼠等。P1和P2家族的基因位于16號染色體上，P1可以直接合成成熟的蛋白質(zhì)，而P2家族成員需要先合成P2前體，經(jīng)過N 端的加工形成不同的家族成員。有證據(jù)表明精蛋白最初來源于組蛋白H1［2，5-6］。

目前認為精蛋白可對精子染色質(zhì)的凝聚、精子遺傳信息的保護及受精后胚胎的正常發(fā)育有重要作用：①精蛋白對父本基本組的包裹使得精子的形狀更符合流體力學，游動速度更快，受精時間縮短；②精子染色質(zhì)的結構模型不同于一般體細胞染色質(zhì)中核小體串珠狀排列的結構模型，較后者濃縮了6倍，使精子染色質(zhì)高度濃縮、結構高度穩(wěn)定，對內(nèi)外環(huán)境中的核酸酶和各種誘變劑及機械損傷的抵抗能力大大提高；③致密包裹的成熟精子轉錄不活潑，這種轉錄惰性能使父本的遺傳信息完整且無干擾的傳給下一代。因此，在受精過程中，由于精蛋白的異常引起精子核不能正常解聚，進一步影響雄原核的形成及其與雌原核的融合；如果精蛋白異常導致精子源性組蛋白再次被包裝入受精卵染色質(zhì)中，妨礙卵裂時染色體的行為及胚胎發(fā)育過程中基因的表達與調(diào)控，使胚胎發(fā)育異常，從而間接地影響了受精及胚胎發(fā)育［7］。

2 精蛋白異常與不育的關系

1976 年，Sliverstroni等報道了少精子癥不育患者的成熟精子缺乏精蛋白成分，提出這是由于精蛋白異?；蛉笔С霈F(xiàn)了精核蛋白轉型障礙所導致的，從而首次提出精蛋白與不育的關系。Balhorn 等通過試驗發(fā)現(xiàn)正常人的P1／P2 為0.98±0.12（n＝17），而不育病人的P1／P2為1.58±0.24（n＝7），此后，大量的研究報道相繼證明了不育樣本與正常樣本相比含有更少的精蛋白，更多的組蛋白和過渡蛋白。在不育病人中，甚至存在P2 的缺失，de Yebra等發(fā)現(xiàn)不育病人的3.4%無法檢測出P2的含量（n＝4），Carrell等發(fā)現(xiàn)17%（13／75）的不育患者檢測不到P2，與能檢測到P2的患者相比，其中12名病患的精子穿透能力下降。而且，在不育患者接受治療后精蛋白的含量還會發(fā)生變化［7］。

關于P1／P2的比值，Aoki V W等［8］給出了較細致的研究結果，正常樣本（n＝87）中P1／P2 為1.06±0.01；在不育樣本中，P1／P2＜0.8 占 到13.6%（n＝37），0.8＜P1／P2＜1.2 有46.7%（n＝127），P1／P2＞1.2 有39.7%（n＝108）病人不育。雖然P1和P2mRNA 含量與其蛋白含量有相關性，然而研究發(fā)現(xiàn)正常樣本（n＝10）中P1 mRNA／P2 mRNA 為1∶1.7，不育樣本（n＝95）的P1mRNA／P2mRNA 為1∶1，與P1／P2 蛋白的比值稍有不同［9］。而Nanassy L等［10］報道正常人群精液中P1／P2比值的范圍應該是0.54～1.43，這說明關于P1／P2與不育的確切關系還需進一步的研究。

除此之外，Khara K K 等［11］將P1／P2的比值與卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精率聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)在不育病人中，當0.55＜P1／P2＜1.29，ICSI受精率≥50%（n＝18），當P1／P2＜0.55或＞1.29，ICSI受精率＜50%（n＝3）。Aoki V W 等［12］發(fā)現(xiàn)精子的穿透能力和受精率在P1／P2 比值異常的患者中顯著降低，Depa-Martynow M 等［13］通過 對92 名患者進行調(diào)查，P1／P2（mRNA 和蛋白）與IVF 受精率、A級胚胎質(zhì)量呈顯著正相關。且有報道指出P2前體／P2、P1／P2的比值與妊娠率明顯相關［14］。

目前認為精蛋白異常可影響精子染色質(zhì)的正常凝聚和穩(wěn)定性，易致DNA 損傷，引起細胞凋亡，并造成精子頭部形態(tài)異常，形成畸形精子，使精子受精能力下降［4，9，13，15］。

3 精蛋白異常的原因

精核蛋白基因表達的調(diào)控環(huán)節(jié)多而復雜，如DNA 水平、轉錄水平、翻譯水平、翻譯后加工等環(huán)節(jié)。這些環(huán)節(jié)的調(diào)控序列大多位于旁側序列中，即使基因編碼區(qū)結構正常，而旁側調(diào)控序列存在異常，亦可在上述環(huán)節(jié)影響精核蛋白的正常合成，導致精核蛋白的穩(wěn)定性及其與DNA 的親和力降低。

3.1 基因多態(tài)性

精蛋白的基因突變或多態(tài)性能夠?qū)е碌鞍椎臉嬒蟀l(fā)生變化，從而影響與DNA 的結合。Tanaka H等［16］報道P1的4個同義單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和P2的1個SNP產(chǎn)生了終止密碼子，P2的翻譯終止使P2含量減少，引起不育。Iguchi N 等［17］在10%（3／30）的病人中發(fā)現(xiàn)SNP 改變了保守的精氨酸殘基，將其變?yōu)榻z氨酸，從而影響正常的精蛋白磷酸化。Aoki V W 等［18］對精蛋白異常的病人做了SNP檢查，發(fā)現(xiàn)15處SNPs，其中P1有3個SNPs，P2有7個，TP1有2個，TP2有3 個，而且這些變化中包含了Tanaka的SNPs，但變化的頻率在對照組中同樣存在。以上研究表明基因多態(tài)性并非引起精蛋白異常的普遍原因。除了研究編碼區(qū)的基因序列，上、下游的非編碼區(qū)的突變也得到了學者的重視。de Jonckheere J等［19］于P2轉錄起始區(qū)的上游GA 重復區(qū)發(fā)現(xiàn)了基因突變。Hammoud S等［20］在P1、P2的非編碼區(qū)識別了14處SNPs。精蛋白基因的表達是一個復雜的多因子調(diào)控的結果，闡明精蛋白表達與精蛋白基因突變之間的關系，還有待于對該基因更多位點的進一步研究。

3.2 轉錄水平的調(diào)節(jié)

精蛋白轉錄的調(diào)節(jié)與核基質(zhì)結合區(qū)（nuclear matrix attachment regions，MARs）和啟動子區(qū)域轉錄因子密切相關。MARs是與核基質(zhì)（或核骨架）特異結合的DNA 序列，精蛋白基因的5′端和3′端都含有MARs，它們是DNA 與轉錄因子結合的順式作用元件，有研究表明當只存在3′-MAR 而5′-MAR 缺失時，會使精蛋白轉錄受到抑制，這是因為3′-MAR有防止精蛋白基因沉默的作用，只有上、下游的MAR 協(xié)同配合才會使精蛋白基因正確的轉錄［21］。

啟動子區(qū)域轉錄因子包括TATA-box 蛋白（TATA-box protein，TBP），cAMP 應答調(diào)節(jié)元件（cAMP response element modulator，CREM）和Y-box蛋白。TBP的重要性體現(xiàn)在精蛋白基因轉錄起始階段，因為它可以結合TATA 序列，有利于RNA聚合酶2發(fā)揮作用。TBP在小鼠18日齡～28日齡過表達，這與單倍體細胞的基因轉錄是一致的［22］。類TBP因子（TBP-like factor，TLF）是一種與TBP序列相似專門結合TATA-less啟動子的蛋白質(zhì)，早期粗線期階段存在于胞質(zhì)中，然后進入核內(nèi)持續(xù)至圓形精子時期，在長形精子時期返回胞質(zhì)中，在轉錄過程中，TLF 可以作為激活物和阻遏物起作用，TLF 缺乏的小鼠出現(xiàn)異常的染色質(zhì)，從而影響HPRR 過程［23］。

轉錄因子CREM 在雄性生殖細胞中高表達，它調(diào)控著一些減數(shù)分裂后基因的轉錄，如過渡蛋白和精蛋白。研究表明CREM 靶基因敲除的雄性小鼠在圓形精子時期就阻止了細胞進一步成熟，導致小鼠不育［24］。

Y-box蛋白是一類重要的精子發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白，它們能夠結合DNA 和RNA，一般上調(diào)轉錄下調(diào)翻譯。在人類和小鼠的生殖細胞中已經(jīng)鑒定了一些Y-box蛋白，其中Contrin和它的小鼠直系同源基因MSY2被認為與精蛋白的表達有關。作為精蛋白基因的轉錄激活物，Contrin／MSY2可以結合啟動子區(qū)域的特定序列，Yang J等［25］用MSY2基因敲除的小鼠模型來研究MSY2的功能，發(fā)現(xiàn)了嚴重的無定型和多核精子細胞。

3.3 翻譯水平的調(diào)節(jié)

精蛋白基因的轉錄發(fā)生在圓形精子細胞時期，隨后mRNAs被存儲在翻譯抑制的核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）中，在長形精子細胞時期激活開始進行翻譯。在這一時期，連續(xù)的核蛋白取代和精子細胞成功分化為成熟精子就顯得至關重要。延遲的mRNA 翻譯阻止了新的mRNA 的合成，避免了過早的染色質(zhì)濃縮。

雖然精蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)不是十分清楚，但是3′端非編碼區(qū)的調(diào)節(jié)位點已經(jīng)被識別。Y-box蛋白Contrin和Translin、驅(qū)動蛋白KIF 17B對延遲翻譯階段RNP轉運到細胞質(zhì)中有著重要的調(diào)節(jié)作用。PolyA 結合蛋白在精蛋白翻譯水平調(diào)節(jié)方面有兩個重要作用，一是防止mRNA 降解，保護翻譯前的mRNA；二是作為阻遏物參與翻譯調(diào)節(jié)。P1RNA結合蛋白（protamine 1 RNA-binding protein，PRBP）在分化的雄性生殖細胞中高表達，結合部位在3′端非編碼區(qū)，PRBP 缺失的雄性小鼠由于精蛋白翻譯失敗，影響了HPRR，最終導致少精和不育［7，26］。

3.4 翻譯后加工的調(diào)節(jié)

精蛋白翻譯后被快速磷酸化，P1 被剪接因子SR——蛋白特異的激酶1（SRPK1）磷酸化，P2前體被Camk4磷酸化，而后水解成成熟的P2?？梢奡RPK1和Camk4的突變成為精蛋白異常表達的潛在因素之一。已有報道證實Camk4的靶點突變會引起P2的喪失和TP2的截留，導致雄鼠不育［27］。Yoshii T 等［28］運用2D技術鑒別了P1的5個變異體，P2的6個變異體，這表明2D 技術將有助于精蛋白翻譯后加工情況的研究。

4 結語

大量的試驗數(shù)據(jù)已經(jīng)證實精蛋白異常會降低雄性動物的生育力，但具體的機理仍有待進一步研究，如精蛋白異常所涉及的基因和蛋白還有哪些，他們是如何其作用的；精蛋白、過渡蛋白的基因突變和多態(tài)性到底在多大程度上調(diào)控著精蛋白的表達；以及精蛋白異常、DNA 損傷、精子表觀遺傳學的變化、生育力下降之間的關系到底是怎樣的；還有沒有精蛋白異常引起不育的其他通路等等。相信這些問題的解決有助于人們更深入地理解精蛋白的功能和不育之間的關系。

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