熊 霞 楊煥勝 印遇龍

(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，長沙 410125)

真菌毒素是真菌在應激下產(chǎn)生的高毒性低分子質(zhì)量的二級代謝物，對人類和動物健康具有潛在危害。真菌毒素對作物(小麥、大麥、燕麥、玉米等)的污染是一個全球性的問題，導致了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中的重大經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，大概全球25%的作物被真菌毒素污染[1]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素，主要由鐮刀菌(Fusarium spp.)產(chǎn)生。這種毒素化學性質(zhì)穩(wěn)定，在加工過程中一般不易破壞，很易于在人類的食品和動物的飼料中找到。

腸黏膜是機體與病原體和毒素接觸的第1道屏障，腸道單層柱狀細胞(腸上皮細胞)通過頂端連接復合體彼此連接。連接復合體可阻止異型生物質(zhì)和微生物進入到機體，但允許營養(yǎng)物質(zhì)和維持機體穩(wěn)態(tài)和生長的物質(zhì)通過[2]。DON、赭曲霉毒素A和棒曲霉素這3種毒素是有名的腸道致病性真菌毒素，它們能改變腸道功能，導致營養(yǎng)不良、腹瀉、嘔吐和腸道炎癥[3]。腸道是 DON吸收的主要部位，如自然霉變的小麥進入豬體內(nèi)后大概15 min即可在血液中檢測到DON的存在，并在(1.65±0.79)h時濃度可達到峰值，表明DON能被快速和幾乎完全地吸收[吸收率達(91.5±27.4)%][4]。攝入中到高劑量的DON如何影響免疫系統(tǒng)已經(jīng)很清楚[1]，但目前對DON在腸道中的作用機制了解甚少。近年來的研究表明，DON抑制了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，破壞腸道屏障和細胞緊密連接，引起了腸道炎癥，并改變了腸道微生物組成。本文將圍繞DON對腸道屏障的影響及其作用機制進行綜述。

1 DON影響腸上皮細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

含真菌毒素的飼料被動物機體消化后，首先與腸道上皮細胞接觸。腸道對營養(yǎng)物質(zhì)(如葡萄糖和氨基酸等)的吸收主要是通過細胞內(nèi)途徑，少量是由旁細胞通路途徑進入。轉(zhuǎn)運蛋白利用電化學梯度把葡萄糖、氨基酸和離子運輸過質(zhì)膜，但DON影響營養(yǎng)物質(zhì)特別是葡萄糖的吸收。Hunder等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂大鼠10 mg/kg的DON 6周后極大地降低了大鼠腸道對葡萄糖的吸收。Maresca等[6]研究表明，低濃度(＜ 10 μmol/L)DON 選擇性調(diào)節(jié)人腸上皮細胞轉(zhuǎn)運載體的活性，而10 μmol/L的DON處理腸上皮細胞48 h后顯著抑制葡萄糖鈉離子依賴性轉(zhuǎn)運載體(SGLT1)和果糖轉(zhuǎn)運載體(GLUT5)的活性。該結(jié)果提示DON抑制蛋白質(zhì)合成和誘導細胞凋亡可能是DON對腸上皮細胞毒性的主要作用機制。Award等[7]通過尤斯灌流室(Ussing chamber)檢測發(fā)現(xiàn)，添加L-脯氨酸能增加雞腸黏膜上的短路電流，但添加DON后則抑制了該短路電流。該結(jié)果提示DON能干擾氨基酸轉(zhuǎn)運載體活性。但Zerull等[8]發(fā)現(xiàn)，5.7 mg/kg的DON并未對豬空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運載體蛋白的合成產(chǎn)生影響，原因可能是5.7 mg/kg的DON劑量并不能影響到腸道轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。目前DON對一些特定腸道氨基酸轉(zhuǎn)運的干擾主要是發(fā)生在RNA轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)合成水平還不太清楚。DON進入機體后主要是在胃到空腸近端處被快速和有效地吸收，少部分到達小腸下端和大腸[9]，并通過腸道微生物脫環(huán)氧化代謝成毒性小的去環(huán)氧DON(DOM-1)，因此DON對大腸毒性作用較小。

2 DON對腸道屏障和細胞緊密連接的影響

腸道是抵御外來抗原入侵的最重要部位，胃腸道(從胃到結(jié)腸)屏障排列著連續(xù)的單層腸上皮細胞，其首要功能就是作為物理屏障隔離來自腸腔的有害物質(zhì)[10]。腸上皮細胞通過位于相鄰上皮細胞間的緊密連接(tight junction)與黏著連接(adherens junction)、縫隙連接(gap junction)和橋粒(desmosome)共同組成連接復合物。緊密連接位于連接復合體的最頂端，限制物質(zhì)通過旁細胞通路轉(zhuǎn)運。腸上皮細胞通過細胞連接進行緊密黏附，限制了小的親水分子的旁路轉(zhuǎn)運?？缒さ鞍兹缇o密連接蛋白家族(claudins)和胞漿蛋白如閉鎖帶蛋白家族(zonula occludens)等維持了屏障的完整性，而DON毒性的一個重要方面是損傷腸道屏障。腸上皮細胞除了維持屏障功能外，還發(fā)展了多種機制防御外來抗原入侵，包括黏液分泌、抗菌肽合成和參與細胞因子/趨化因子網(wǎng)絡等[11]。

眾所周知，DON是RNA、DNA和蛋白質(zhì)合成的潛在抑制劑。DON與60S核糖體亞基中的肽基轉(zhuǎn)移酶反應，誘導了所謂的“核糖體失活反應(ribotoxic stress response)”，激活了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[12]。MAPK通路中的信號分子能調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能[13]。MAPK信號通路是細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的重要組成部分。目前細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)/大絲裂原活化蛋白激酶-1(BMK1)等4個MAPK亞族在哺乳動物細胞中被克隆和鑒定。不同MAPK亞族被其上游激酶激活后，可通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架相關(guān)蛋白和酶類等多種底物來調(diào)節(jié)多種細胞生理過程，包括傳導下游的免疫反應和細胞凋亡信號[14]。Van de Walle等[15]發(fā)現(xiàn) DON通過抑制蛋白質(zhì)合成影響腸上皮細胞間的緊密連接，從而破壞腸道屏障，但其內(nèi)在機制并不清楚。Pinton等[16]發(fā)現(xiàn)DON能誘導P44/42 ERK信號通路的激活，抑制緊密連接蛋白-4的表達，從而導致腸屏障功能受損。但目前人們對核糖體反應中的上游激酶如何被激活并不清楚。小腸上皮細胞單分子膜的跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant，TER)被認為是上皮完整性和組織細胞單分子層緊密連接程度的一個重要指標。緊密連接蛋白表達的變化可能會減少上皮細胞層的TER，導致了細胞單分子層通透性的增加，增加了旁細胞通路轉(zhuǎn)運和超大分子的吸收，增加了細菌移位的機會。Sergent等[17]的研究表明，DON在腸上皮細胞的轉(zhuǎn)運主要是通過細胞旁路被動擴散，少部分是跨細胞轉(zhuǎn)運。長時間暴露于DON能引起MAPK信號通路中ERK1/2、p38和應激活化蛋白激酶(SAPK)/JNK的磷酸化，減少人結(jié)腸癌上皮細胞(CaCo-2)的TER，引起腸道炎癥。

3 DON對腸上皮細胞的其他影響

IPEC-J2是從未哺乳的新生仔豬空腸分離的腸上皮細胞，是非轉(zhuǎn)化型的起始連續(xù)培養(yǎng)小腸細胞系，具有典型的豬小腸上皮細胞特性，是研究營養(yǎng)素等物質(zhì)與小腸上皮細胞間作用機制的良好模型[18]。Diesing 等[19]用不同劑量(200和2000ng/mL)的DON處理豬IPEC-1和IPEC-J2，發(fā)現(xiàn)高劑量的DON能對這2種細胞產(chǎn)生毒性作用，包括對細胞的活性、分化、緊密連接和周期等都有影響;而低劑量的DON對細胞的影響很小，表明了低劑量與高劑量的DON在腸上皮細胞上的作用機制不同。此外，Accensi等[20]在斷奶仔豬上的試驗表明，低劑量(0、280、560 和 840 μg/kg)的DON并未對豬的血液生化以及免疫各指標產(chǎn)生影響。該結(jié)果與Doll等[21]的研究結(jié)果一致，這些結(jié)果能為豬飼料中DON的最低檢測限提供依據(jù)。此外，DON對動物的影響與飼料受污染程度、動物的年齡以及飼養(yǎng)期有關(guān)[22]。Pestka[23]的研究表明，真菌毒素同時具備免疫激活或免疫抑制功能，這與劑量、頻率、暴露時間以及免疫細胞的類型有關(guān)。腸上皮細胞的極化結(jié)構(gòu)對于其功能的行使極為重要，腸上皮細胞基頂膜和基底膜分工各有不同。基頂膜上含有大量的酶和轉(zhuǎn)運載體復合物，如乳糖酶、蔗糖酶和氨基肽酶等，協(xié)助腸腔營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收。而基底膜上主要以營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸或糖的轉(zhuǎn)運載體為主。DON被腸道吸收時與上皮細胞在基頂側(cè)發(fā)生反應，進入到血液中的DON則通過血液與腸上皮細胞基底側(cè)接觸。Diesing等[9]檢測了DON對 IPEC-J2細胞活力和緊密連接的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同的DON濃度從基底側(cè)接觸比基頂側(cè)對腸道屏障的完整性破壞更嚴重。此外，為了維持腸道屏障功能，上皮需要持續(xù)更新。來源于隱窩干細胞的腸上皮細胞沿隱窩-絨毛軸向絨毛端遷移，遷移過程逐漸分化為成熟的腸上皮細胞，并最終在絨毛頂端脫落，分化成熟后的腸上皮細胞有著顯著的頂角結(jié)構(gòu)和上千個微絨毛[24]。動物研究中把腸道形態(tài)學指標(上皮細胞增殖、隱窩深度和絨毛高度)作為檢測動物是否健康的一個指標。Maresca等[6]的研究表明DON能影響人結(jié)腸上皮細胞的增殖。

4 DON對腸道炎癥和腸道微生物組成的影響

目前很多研究集中在DON污染的食物或飼料對胃腸道的直接影響，盡管它們對腸道屏障和轉(zhuǎn)運活性的影響已經(jīng)逐漸明確，但目前人們對它們的促炎機理仍知之甚少。腸上皮細胞對外界各種刺激分泌出炎性介質(zhì)，激活腸上皮細胞以下的免疫細胞，觸發(fā)腸道黏膜防御中的炎癥反應。單核細胞、巨噬細胞以及T淋巴細胞和B淋巴細胞是DON的作用靶標。細胞因子是小肽分子，它們對于調(diào)節(jié)免疫和炎性反應非常重要，由淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞產(chǎn)生。Mbandi等[25]研究表明，DON具有促進小鼠巨噬細胞趨化因子和促炎細胞因子，包括白介素 -1β(IL-1β)、白介素 -6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-2)表達的作用。Maresca等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DON通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子IL-1β活性或增加腸道共生大腸桿菌的跨膜通道，間接刺激白介素-8(IL-8)的分泌。這些結(jié)果表明，DON對腸道不僅具有直接的促炎作用，也可通過腸道屏障功能改變而間接引起腸道炎癥。Van de Walle等[26]在Caco-2細胞上的研究表明，DON能誘導活化核因子-κB(NF-κB)的活化及刺激IL-8的分泌，并存在劑量依賴性。而這2個因子刺激了促炎，提示高劑量的DON可能導致或加劇腸道炎癥。Vandenbroucke等[27]研究了低濃度的DON與鼠傷寒沙門氏菌誘發(fā)的早期腸道炎癥之間的關(guān)系，結(jié)果表明，攝入DON污染的食物或飼料后，可能導致腸上皮細胞更容易被病原體如沙門氏菌侵入，而且加重了后續(xù)的腸道炎癥。Noqueira等[28]通過蛋白質(zhì)組學研究了人的2種淋巴細胞系在DON處理后蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)包含在蛋白酶體降解途徑中蛋白質(zhì)的上調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄因子的激活以及細胞因子的變化有關(guān)。

此外，腸道菌群是影響動物健康的一個重要因素，機體的免疫反應與腸道菌群發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物間有著密切關(guān)系[29]。有研究者通過體外試驗調(diào)查了腸道菌群和單端孢霉菌毒素之間的相互作用，以確定菌株是否能減少霉菌毒素的毒理效應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選的細菌能與DON結(jié)合，并通過脫環(huán)氧化作用降低的毒性作用[30-31]。Wache 等[32]首次通過毛細管電泳單鏈構(gòu)象多態(tài)性(CE-SSCP)在體研究了DON對腸道微生物的影響，發(fā)現(xiàn)DON改變了腸道微生物的組成。

5 小結(jié)

腸道是抵抗病原體和微生物入侵的第1道屏障，開展DON對腸道屏障的影響及其作用機制的研究對于調(diào)節(jié)人類和動物的健康非常有意義。抑制蛋白質(zhì)合成和誘導細胞凋亡是DON的毒性機理之一，此外，它還可以通過減少細胞緊密連接蛋白來破壞腸道屏障。然而，目前對DON介導的腸上皮細胞的作用機制如“核糖體失活反應”中對上游激酶激活的影響、抗菌肽的產(chǎn)生等仍然了解甚少，其詳細機制需要進一步的研究。在今后的研究中，應該結(jié)合分子生物學、功能基因組學等各種技術(shù)和方法，從細胞和分子水平進行深入研究，以深入揭示DON的作用機理。

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