陳秀華，王臻昱，李先平，朱延明，劉 麗，陳 威，陳 勤,6*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，昆明 650205；2.云南田瑞種業(yè)有限公司，昆明 650205；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；4.中國(guó)科學(xué)院東北地理與生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，昆明 650205；6.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部萊斯布里奇研究中心，加拿大 艾伯塔省 萊斯布里奇 T1J4B1）

植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs，EC 2.5.1.18）是一類(lèi)普遍存在的，由一個(gè)龐大而復(fù)雜的基因家族所編碼，具有多種生物學(xué)功能的一組同工酶。這類(lèi)酶用于催化谷胱甘肽與有毒異源物或氧化產(chǎn)物結(jié)合，從而促進(jìn)此類(lèi)物質(zhì)的代謝、區(qū)域化隔離或清除。根據(jù)序列相似性可將其分為三種類(lèi)型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）[1]，Ⅰ型包括具有除草劑解毒活性的GSTs，這類(lèi)基因均包括3個(gè)外顯子；Ⅲ型為植物激素誘導(dǎo)的GSTs，包括兩個(gè)外顯子；Ⅱ型有10個(gè)外顯子，與哺乳動(dòng)物的zeta GSTs相近。有學(xué)者建議將擬南芥中類(lèi)似于哺乳動(dòng)物theta GSTs劃分為Ⅳ型[2]。另有將其分為八種亞類(lèi)，其中 phi，tau，theta，zeta，lambda 和DHAR（Dehydroascorbate reductase，谷胱甘肽依賴(lài)的抗壞血酸還原酶）和TCHQD（Tetrachlorohydroquinone dehalogenase，四氯代氫醌脫鹵素酶）亞類(lèi)為可溶性GSTs，可溶性的植物谷胱甘肽還原酶也是本文主要探討的內(nèi)容。另一個(gè)亞類(lèi)為微粒體的GSTs[3]，它和主要的GST超家族關(guān)系不大，但是具有相似的谷胱甘肽依賴(lài)的活性，在谷胱甘肽代謝中是一種膜關(guān)聯(lián)蛋白。動(dòng)物上也有theta和zeta相似結(jié)構(gòu)的GSTs，其余結(jié)構(gòu)均為植物所特有[4]?；蚍治龊椭参锘蚪M工程表明，GSTs由超過(guò)40種基因編碼，而這些編碼蛋白僅有10%的序列相似性[5]。大豆中有25個(gè)GSTs基因，玉米中有42個(gè)[5]，而擬南芥中有48個(gè)該基因家族成員，其中tau和phi最為豐富。GSTs對(duì)于細(xì)胞異源物質(zhì)的清除，細(xì)胞解毒作用，以及提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受具有重要作用。

1 GSTs的結(jié)構(gòu)

可溶性GST是分子質(zhì)量為50 ku二聚體疏水蛋白[4]，每個(gè)亞基大小為23～30 ku。目前，已了解結(jié)構(gòu)信息的植物GSTs包括擬南芥phi和zeta亞類(lèi)、小麥、水稻GST1（OsGSTU1）和玉米的tau亞類(lèi)。

GSTs基因的序列相似性較低，但通過(guò)對(duì)大量GST蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)GST蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性。每個(gè)亞單元包括兩個(gè)不同的域，N末端和C末端是由一個(gè)α螺旋連接的分別為βαβ和ββα結(jié)構(gòu)的不同基序。大部分胞液GSTs以同質(zhì)或異質(zhì)二聚體亞基形式發(fā)揮酶活性。植物中唯一有活性的GSTs單體是擬南芥lambda和DHARs[6]。對(duì)于phi和tau亞基來(lái)說(shuō)，只有同一類(lèi)型的亞基才能二聚化。在重組細(xì)菌中共表達(dá)GSTs亞基顯示二聚體化是自發(fā)的，但這種自發(fā)性?xún)H限同類(lèi)亞基[7]。玉米tau GSTs ZmGSTⅤ和ZmGSTⅥ亞基形成異源二聚體和同源二聚體的可能性是相同的，然而phi GSTs ZmGSTⅠ和ZmGSTⅡ亞基更傾向于形成異源二聚體[7]。

X射線(xiàn)晶體衍射顯示擬南芥和玉米的三個(gè)phi類(lèi)GSTs有相似的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但卻僅有20%的序列相同。每個(gè)亞基N末端域均有保守的結(jié)合谷胱甘肽的G位點(diǎn)，C末端的H位點(diǎn)為谷胱甘肽的結(jié)合提供一個(gè)高度保守的天冬氨酸殘基和能夠與疏水配體結(jié)合的大部分殘基[8]。G位點(diǎn)是接納GSH的特異部位，并且該位點(diǎn)能促成有催化活性的谷胱甘肽硫負(fù)離子形成。在三個(gè)phi GSTs中，活性部位位于兩個(gè)亞基構(gòu)成的大開(kāi)口裂縫的其中一個(gè)側(cè)面上，平面和球形的大分子可以通過(guò)，而且每個(gè)活性位點(diǎn)和鄰近亞基有較輕微相互作用[9]。

2 GSTs的功能

2.1 解毒功能

GSTs最重要的一個(gè)功能就是失活有毒化合物的能力。異源物質(zhì)在植物體內(nèi)的代謝主要分為三個(gè)階段：階段Ⅰ（轉(zhuǎn)化）、階段Ⅱ（結(jié)合）和階段Ⅲ（區(qū)域化）[10]。GSTs能催化谷胱甘肽中巰基基團(tuán)對(duì)不同親電分子進(jìn)行親核攻擊，使外源性化合物與內(nèi)源的還原谷胱甘肽（GSH）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)[11]。許多外源化學(xué)物在生物轉(zhuǎn)化階段I中極易形成某些生物活性中間產(chǎn)物，它們可與細(xì)胞生物大分子重要成分發(fā)生共價(jià)結(jié)合，對(duì)機(jī)體造成損害。谷胱甘肽與其結(jié)合后，可防止此種共價(jià)結(jié)合的發(fā)生。

2.2 跨膜運(yùn)輸定位

在植物中，很多次生代謝物對(duì)植物，甚至對(duì)產(chǎn)生它們的細(xì)胞都是有毒的。因此，將它們定位到合適部位（通常為液泡）很關(guān)鍵。谷胱甘肽泵能夠識(shí)別與GSH結(jié)合而標(biāo)記的內(nèi)源底物和異源物質(zhì)。在酶的作用下，ATP依賴(lài)的膜泵能夠識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)軛合物跨膜排泄或隔離?；ㄇ嗨匦枰cGSH結(jié)合才能轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中[10]。色素在胞液中不當(dāng)?shù)臏舨坏璧K色素形成，而且會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[12]。

2.3 保護(hù)細(xì)胞免受氧化損失

羥自由基起始的氧化損傷內(nèi)源產(chǎn)物具有很高的細(xì)胞毒性。包括膜脂過(guò)氧化物和DNA氧化降解產(chǎn)物等。GSTs使GSH和這種內(nèi)源的親電體結(jié)合已達(dá)到脫毒的作用。某些GSTs也作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶直接發(fā)揮脫毒作用[13]。

2.4 配體蛋白：非酶結(jié)合和胞內(nèi)運(yùn)輸

GSTs還可能作為配體蛋白起作用。作為非底物配體的化合物，它們與GSTs綁定的位點(diǎn)與酶催化位點(diǎn)不同。植物中某些GSTs作為天然植物激素IAA的載體發(fā)揮作用。它們之間會(huì)形成植物激素結(jié)合蛋白而不是IAA-GSH共軛物。擬南芥GSTs Atpm24.1能夠綁定光親和的IAA類(lèi)似物。但是這個(gè)酶卻不能將GSH結(jié)合到IAA上，所以認(rèn)為IAA類(lèi)似物可能結(jié)合在距離活性中心較遠(yuǎn)的另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上，結(jié)合方式與類(lèi)固醇和卟啉衍生物類(lèi)似[14]。這種非酶綁定可能允許IAA的臨時(shí)儲(chǔ)存和IAA活性、通過(guò)細(xì)胞膜的攝入和運(yùn)輸?shù)绞荏w的調(diào)控。GSTs配體蛋白的功能可能與預(yù)防分子在膜上或細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度積累導(dǎo)致的細(xì)胞毒性有關(guān)。

3 植物GSTs研究進(jìn)展

GSTs不僅在正常細(xì)胞代謝和異質(zhì)化合物的解毒方面均發(fā)揮著重要作用，對(duì)提高植物耐受不良環(huán)境條件、抵抗損傷等方面同樣起重要作用。多種作物中的GSTs能夠受到多種不同環(huán)境刺激誘導(dǎo)，如真菌攻擊、干旱脅迫、乙烯和傷口等[1]。

大豆中GH2/4（也稱(chēng)為Gmhsp26-A）基因分別作為熱激蛋白和植物激素誘導(dǎo)蛋白被獨(dú)立克隆。通過(guò)分析這個(gè)蛋白與其他GSTs同源性和促使GSH和模式 底 物 CDNB（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，1-氯-2，4-二硝基苯）發(fā)生結(jié)合的作用，確認(rèn)它為GST。除熱激和植物激素，包括ABA（Abscisic acid，脫落酸）、KT（Kinetin，激動(dòng)素）、GA3（Gibberellic acid，赤霉素）、 PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）、KCl、NaF和重金屬等一系列化學(xué)物質(zhì)均能誘導(dǎo)GH2/4信使[5]。

3.1 GST降低異源物質(zhì)毒性研究

最早發(fā)現(xiàn)的植物GSTs的功能即為它能代謝除草劑轉(zhuǎn)變?yōu)榉嵌拘问?。已發(fā)現(xiàn)幾種主要的除草劑都能被GSH結(jié)合，而這種結(jié)合不會(huì)傷害目的酶。

高等植物中，還原型谷胱甘肽（GSH）和GSTs在降解某些異源物質(zhì)中起到非常關(guān)鍵的作用?？扇苄缘腉STs介導(dǎo)GSH或其同系物與除草劑發(fā)生結(jié)合反應(yīng)而引發(fā)其降解[15]。Xu等用乙草胺處理小米、高粱和玉米幾種作物幼苗以誘導(dǎo)GSH和GSTs，當(dāng)處理濃度不同時(shí)，硫醇含量和GSTs活性先隨著處理濃度升高而升高，達(dá)到頂峰時(shí)開(kāi)始下降，且這種趨勢(shì)在這幾種不同作物上的表現(xiàn)是相同的[16]。誘導(dǎo)的GST活性程度和硫醇含量與不同作物對(duì)乙草胺的抗性程度相關(guān)，因此推測(cè)內(nèi)源的GSH庫(kù)水平和GSTs活性與作物抵抗外源有毒物質(zhì)的保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)。May等也認(rèn)為GSH的含量水平對(duì)植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)能力十分重要[17]，結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH含量突然降低。當(dāng)體內(nèi)GSH消耗過(guò)多時(shí)，胞質(zhì)中GSH庫(kù)含量的恢復(fù)速度可能影響植物抵抗脅迫的能力和對(duì)除草劑的耐受性[17]。

玉米GSTIV可以響應(yīng)安全劑和一系列除草劑的脅迫。安全劑就是通過(guò)激活GST基因來(lái)加快植物體內(nèi)除草劑代謝的[18]。

3.2 GSTs在植物非生物脅迫中的作用

先前的研究表明植物GSTs基因可以響應(yīng)多種非生物脅迫，包括脫水、UV、冷害、干旱、高鹽和ABA[19]。表明GSTs基因在植物抵抗非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

3.2.1 低溫

在煙草中超量表達(dá)一種同時(shí)編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）活性酶的cDNA，其GST和GPX活性均較野生型高出兩倍。在寒冷脅迫條件下這些GST/GPX超量表達(dá)的煙草幼苗的生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照。冷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草中氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量顯著高于野生型，用GSSG處理野生型幼苗可加速其生長(zhǎng)，而用還原型的谷胱甘肽或用其他巰基還原劑處理野生型幼苗則會(huì)抑制其生長(zhǎng)。因此，超量表達(dá)GST/GPX可加速轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在冷脅迫條件下的生長(zhǎng)，而這種現(xiàn)象可能是谷胱甘肽庫(kù)中氧化型谷胱甘肽含量高造成的[20]。

Huang等從鱗翅目云杉蚜蟲(chóng)—云杉卷葉蛾中克隆得到一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，并將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中[21]。分別將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥置于4和10℃條件下48 h研究其對(duì)于低溫的耐受作用。在4和10℃處理48 h后，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因擬南芥的GST活性分別高于野生型46.6%和35.7%，轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)膜透性和丙二醛含量均高于野生型，而葉綠素含量和脯氨酸含量均低于野生型。轉(zhuǎn)基因擬南芥在0℃處理24 h成活率為43.7%，而野生型成活率僅為28.3%。結(jié)果表明插入GST基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性。在水稻中表達(dá)鹽地堿蓬的GST或共表達(dá)GST和CAT1（Catalase 1，過(guò)氧化氫酶1）基因，低溫處理后，轉(zhuǎn)基因植株的GST和CAT活性及PSⅡ最大光化學(xué)效率都比未轉(zhuǎn)入這兩種基因的對(duì)照高；細(xì)胞膜透性及H2O2和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量則低于對(duì)照。說(shuō)明GST和GST+CAT1基因在轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的表達(dá)能夠提高其對(duì)低溫的抗性[22]。

3.2.2 干旱

植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量受到多種非生物脅迫因子的負(fù)向影響。George等應(yīng)用耐干旱的葇荑牧豆樹(shù)作為模式植物體系用于開(kāi)發(fā)非生物脅迫耐受基因的功能[23]。用干旱脅迫2月齡的葇荑牧豆樹(shù)的葉片建立cDNA文庫(kù)，通過(guò)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模的隨機(jī)EST測(cè)序，鑒定出三個(gè)不同的由生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。PjGSTU1是其中的一個(gè)定位于線(xiàn)粒體，并可提高轉(zhuǎn)基因煙草干旱耐受能力的GST基因。在大腸桿菌中超量表達(dá)PjGSTU1，重組菌種PjGSTU1蛋白是由一個(gè)功能性的同源二聚體構(gòu)成的，具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。轉(zhuǎn)PjGSTU1基因煙草株系在15%PEG脅迫下較非轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)良好。GFP融合技術(shù)表明PjGSTU1蛋白定位于轉(zhuǎn)基因煙草的線(xiàn)粒體中。PjGSTU1的過(guò)氧化物酶活性和定位于線(xiàn)粒體說(shuō)明該基因可能對(duì)于活性氧的清除起作用。

3.2.3 耐鹽

存在于土壤和灌溉水中的滲透脅迫物質(zhì)，離子毒性物質(zhì)和高鹽，特別是Na+和Cl-嚴(yán)重?fù)p害植物生長(zhǎng)，鹽害是作物減產(chǎn)的主要因素之一[24]。

Roxas等在煙草中超量表達(dá)一種同時(shí)編碼GST和GPX活性酶的cDNA，在鹽脅迫條件下這些GST/GPX超量表達(dá)的煙草幼苗的生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照[20]。將克隆于鹽地堿蓬中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)對(duì)鹽脅迫下野生型植株（WY）和T3代純合子轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（GT）的生物量和谷胱甘肽（氧化型：GSSG；還原型：GSH）含量測(cè)量發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因植株的生物量和GSSG含量在轉(zhuǎn)基因品系中比野生型的含量均高。試驗(yàn)表明，GST基因的過(guò)量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)，這種結(jié)果也可能是通過(guò)氧化還原型谷胱甘肽來(lái)實(shí)現(xiàn)的[25]。

4 展望

植物對(duì)干旱、鹽堿及低溫耐性的強(qiáng)弱不只由某一個(gè)因子決定，其性狀受眾因子的共同影響。這種抵抗非生物脅迫復(fù)雜的機(jī)制加大了采用基因工程方法有效改良植物脅迫耐性的困難程度。通過(guò)分子育種導(dǎo)入或改良個(gè)別功能基因?qū)μ岣咧参锟鼓嫘杂邢?，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)需要，即使進(jìn)行多基因的聯(lián)合導(dǎo)入，各基因間的相互協(xié)調(diào)問(wèn)題難以解決。深入了解GSTs基因功能和調(diào)控機(jī)制，將有助于抗逆轉(zhuǎn)基因育種研究。

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