閆師杰 ，廉雙秋 ，李曉丹 ，李 玲 ，朱文嬙，趙 越*

（1.天津農(nóng)學院食品科學系，天津 300384；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030）

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Yali）是我國白梨品系的優(yōu)良主栽品種，果實較耐貯藏，采用冷藏方法可以貯藏到第二年2～3月，鴨梨貯藏的主要問題是近果心部位組織褐變。閆師杰[1]研究認為，鴨梨果心較果肉過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性較低，維生素C及GSH含量下降較快，導致果心較果肉更容易積累自由基，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，最終導致膜透性升高，果心較早褐變。植物過氧化物酶（EC 1.11.1.7）的誘導蛋白質(zhì)在植物防御期間發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。整個植物生命周期POD參與廣泛的生理過程，可能是由于存在大量的同工酶和多功能酶催化反應[4]。一方面植物POD參與生長素代謝，木質(zhì)素和木栓質(zhì)形成，交聯(lián)細胞壁成分，植保素的合成，它是一族能催化H2O2、氧化還原無機氫供體的酶[5-6]；另一方面與植物逆境脅迫誘導表達有關(guān)，例如：POD在病原菌的防御、冷凍、重金屬離子、機械損傷等因子作用下誘導表達[7-10]，是植物抗氧化保護酶系的重要保護酶，是植物應對環(huán)境脅迫的生物標記之一[11]。目前已從數(shù)百種物種中克隆到POD基因，在GenBank登錄的POD基因序列有1 000多個，而關(guān)于梨屬的僅有2個片段，且是不完整的POD基因序列，鴨梨完整的POD基因序列及相關(guān)信息還未見報道。本研究根據(jù)已發(fā)表的梨屬POD基因片段，利用RACE技術(shù)從鴨梨果實中克隆得到1個完整的POD基因cDNA。通過序列分析進一步揭示該酶的基因序列信息及表達特性，為最終調(diào)控植物體內(nèi)過氧化物酶活性，抑制果實酶促褐變奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、載體和菌株

以采自河北省藁城的套袋鴨梨為試材，于2011年9月16日采摘，運回實驗室，經(jīng)梯度降溫后放入冷庫貯藏。在貯藏期間將鴨梨果實切成塊狀于液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆??？寺≥d體pMD18-T Vector購于大連寶生物公司，大腸桿菌菌株E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑、DNA聚合酶、DNA純化回收試劑盒（購自索萊寶公司）；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（購自大連寶生物公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（購自上海生工）；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（購自Clontech公司）；其他常規(guī)藥品均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。DNA序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上FJ478154.1公布的梨屬POD基因的mRNA及CDS信息，用軟件primer5.0設(shè)計引物POD-F、POD-R，經(jīng)PCR擴增得到該基因的保守片段并測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物PODF1、PODF2用于cDNA的3'RACE擴增；設(shè)計引物PODR1、PODR2用于cDNA的5'RACE擴增；最后根據(jù)保守區(qū)、3'RACE、5'RACEcDNA序列的拼接結(jié)果，設(shè)計引物PODF3、PODR3用于POD基因cDNA全長擴增。

表1 PCR反應中使用的引物Table1 Primers in PCR

1.2.2 鴨梨POD基因cDNA全長的獲得

鴨梨果實總RNA提取采用CTAB法提取[12]，反轉(zhuǎn)錄反應參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書，Oligo（dT）為引物合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板用引物對POD-F、POD-R進行擴增，擴增程序為：95℃預變性4 min，94℃變性35 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠回收與預期目的片段大小一致的條帶，電泳檢測后連接克隆載體（pMD18-T Vector）并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選及質(zhì)粒酶切鑒定陽性克隆后，送交測序。

根據(jù)克隆所得到的cDNA中間序列分別設(shè)計特異性引物PODF1、PODF2、PODR1和PODR2，按照RACE試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書操作，進行3'RACE和5'RACEcDNA末端快速擴增，將測序所得的中間序列及3'RACE和5'RACE序列進行拼接得到POD cDNA全長序列，再根據(jù)克隆所得全長序列設(shè)計引物PODF3和PODR3，以5'cDNA為模板，用于擴增POD cDNA全長，將該擴增產(chǎn)物回收并連入克隆載體后進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨梨POD基因的全長的cDNA的獲得

根據(jù)鴨梨POD基因保守區(qū)設(shè)計引物POD-F、POD-R，以鴨梨果實cDNA為模板經(jīng)PCR擴增及測序得到一個長度為445 bp的cDNA片段（見圖1A）。依據(jù)所得中間序列設(shè)計特異性引物PODF1、PODF2、PODR1、PODR2，進行PCR擴增獲得鴨梨POD基因的3'（見圖1B）和5'（見圖1C）cDNA末端序列，將測序后的中間片段及3'和5'末端序列拼接得全長1 487 bp的鴨梨POD基因序列。再根據(jù)該序列設(shè)計特異性擴增引物，經(jīng)過PCR擴增后獲得基因全長（見圖1D）。將該基因提交GenBank，基因登錄號為JQ325052。

圖1 鴨梨PbPOD基因擴增電泳Fig.1 Electrophoresis pattern of PbPOD for Yalipear

2.2 鴨梨POD基因cDNA核苷酸序列分析

利用NCBI上提供的ORFFinder對該序列進行分析，發(fā)現(xiàn)鴨梨POD基因包含一個1 011 bp的編碼區(qū)（CDS）；3'非翻譯區(qū)長404 bp，含有典型的植物基因加尾信號序列Poly（A）；5'非翻譯區(qū)長72 bp，起始密碼子ATG后的第一個核苷酸為鳥苷酸（G），上述信息表明所克隆到的序列符合完整基因的結(jié)構(gòu)特征，是一個完整的基因序列。

2.3 鴨梨過氧化物酶基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能位點分析

2.3.1 過氧化物酶基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)

ORFFinder分析表明，該基因的開放閱讀框在73～1 083 bp區(qū)域，編碼一個由336個氨基酸殘基組成的多肽，推測分子質(zhì)量大小為38.4 ku，等電點（pI，Isoelectric point）為8.54，原子總數(shù)為5 386，分子式為C1690H2691N487O499S19，不穩(wěn)定系數(shù)為52.67，其為不穩(wěn)定親水性蛋白。

蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，PbPOD基因包含8個半胱氨酸形成4個二硫鍵，二級結(jié)構(gòu)螺旋之間由環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主且占56.6%，α-螺旋占41.3%，β-折疊結(jié)構(gòu)很少占2.1%。PbPOD與第Ⅲ類植物POD蛋白相比具有很強的結(jié)構(gòu)類似性，可以初步判斷鴨梨POD屬于第Ⅲ類植物過氧化物酶超家族。通過同源建模法獲得PbPOD的理論三維結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖2（圖2彩版見封二）。POD分子由兩個不同的結(jié)構(gòu)域組成，中間黃色部分為包埋著的血紅素輔基，血紅素平面上方遠端的“空穴”是H2O2的作用位點，它還含有兩個Ca2+結(jié)合區(qū)，一個Ca2+結(jié)合區(qū)位于近端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，另一個位于遠端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這在第III類POD中是高度保守的。

圖2 PbPOD蛋白的三級立體結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Predicted tertiary structure of the PbPOD

2.3.2 POD蛋白的功能位點分析

通過NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）的保守域檢索及立體結(jié)構(gòu)預測工具Conserved Domain Database（CDD），發(fā)現(xiàn)POD蛋白具有兩個保守功能域Cd00693（Secretory peroxidase，分泌性過氧化物酶）和Cl00196（Plant-peroxidaselike superfamily，植物過氧化物酶超家族）。進一步證明所獲得基因就是鴨梨的過氧化物酶基因（見圖3，圖3彩版見封二）。

2.3.3 Pb-POD蛋白的分子進化關(guān)系分析

通過NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫對PbPOD編碼的蛋白序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列與海欖雌（Avicennia marina）（BAB16317.1）POD有99%的相似性，與陸地棉（Gossypium hirsutum）POD（AAA99868.1）、木欖（Bruguiera gymnorhiza）POD（ADD54644.1）、油茶（Camellia oleifera）POD（ACT21094.1）、長春花（Catharanthus roseus）（AAY26520.1）、蓮花（Nelumbo nucifera）（ABN46984.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）（CAB71128.2）有96%的相似性，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）（CAA17163.1）、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）（ABC02343.1）有95%的相似性，煙草（Nicotiana tabacum）（AAD33072.1）有93%的相似性，甜瓜（Cucumismelo subsp.Melo）（ADN34050.1）有92%的相似性，與多個物種POD基因所編碼的蛋白序列相似性達90%以上，確定克隆得到的基因是與鴨梨褐變相關(guān)的POD基因。

圖3 PbPOD基因編碼的氨基酸序列的預測Fig.3 Predicted amino acid sequenceof PbPOD

為進一步闡明PbPOD與其他植物中POD蛋白之間的進化關(guān)系，使用Clustal X軟件分析各POD蛋白序列之間的相似性，對包括PbPOD在內(nèi)的植物POD蛋白進行聚類分析，使用MEGA5軟件構(gòu)建出一個分子進化樹（見圖4）。

圖4結(jié)果顯示，PbPOD與擬南芥的POD蛋白在進化關(guān)系上距離相對最近，表明它們可能是從同一祖先進化而來。

圖4 鴨梨PbPOD與其他植物中POD之間的分子進化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic evolution analysisbetween PbPOD in Yalipear and other plants

3 討論與結(jié)論

本研究利用RT-PCR和RACE方法，從鴨梨果實中成功克隆出一條完整的過氧化物酶基因，該基因包含全長為1 011 bp的編碼區(qū)，編碼336個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)螺旋之間以環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主，其次是α-螺旋，β-折疊結(jié)構(gòu)很少。蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)可以決定蛋白質(zhì)的功能，酶的功能部位常處于這種構(gòu)象區(qū)域；而α-螺旋的主要功能是對蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定作用。本研究通過序列分析和氨基酸序列比對得到的結(jié)果，為進一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和生化特性奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明，POD基因與木栓質(zhì)和木質(zhì)素的合成有關(guān)，而POD酶被認為是抵抗病原侵入的重要防衛(wèi)手段[13-15]。同時，研究表明在植物受到重金屬、低溫等條件的脅迫下，POD蛋白的表達量也隨之顯著增加[16-17]。但是，基因POD在病原菌防衛(wèi)反應和植物抗逆反應中的作用還不完全清楚。因此，鴨梨POD基因的克隆為揭示POD結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供較好的研究材料和基礎(chǔ)，最終闡明其作用機理，為鴨梨采后酶促褐變的機理研究奠定重要的分子生物學基礎(chǔ)。

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