于延淼 遼寧省鐵嶺市昌圖縣畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)站 112500
多種組織來(lái)源的體細(xì)胞如乳房上皮細(xì)胞、各種成纖維細(xì)胞、卵丘/顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等都可以用于克隆動(dòng)物,但來(lái)源于不同組織或細(xì)胞種類的細(xì)胞的重編程能力和核移植效率明顯不同。有些種類的供核細(xì)胞雖然能夠得到克隆囊胚,但是沒(méi)有獲得克隆后代。
多數(shù)研究表明,在核移植過(guò)程中,采用來(lái)源于胚胎和新生動(dòng)物的細(xì)胞作為供核細(xì)胞,其克隆胚胎具有相似的囊胚發(fā)育率,但是胎兒細(xì)胞卻更容易得到健康的新生動(dòng)物。這可能是由于胎兒細(xì)胞的分化程度較低,在重組胚中更容易啟動(dòng)重編程。而成體動(dòng)物由于年齡較大,體細(xì)胞分化程度較高,積累了較多的損傷和突變,因此導(dǎo)致重組胚胎發(fā)育能力降低。但是也有研究認(rèn)為,體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育率與供體細(xì)胞動(dòng)物的年齡無(wú)關(guān)。采用傳代早期的細(xì)胞,似乎更有利于核移胚的發(fā)育。
當(dāng)核供體進(jìn)入MⅡ期卵母細(xì)胞質(zhì)后經(jīng)過(guò)激活,會(huì)發(fā)生移入核的核膜崩解(NEBD)、染色體超前濃縮(PCC)、核仁分散、核膜重新出現(xiàn)和類原核的形成(PN)以及原核膨大等一系列形態(tài)學(xué)變化。
豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及體外發(fā)育能力與成熟液和培養(yǎng)條件有密切的聯(lián)系?,F(xiàn)在普遍用兩種基本的成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液NCSU-23和TCM 199。一般有兩種培養(yǎng)條件,其一為38.5℃、5%的CO2和95%的空氣,其二為38.5℃、5%的CO2、5%的O2和90%的N2。選擇合適卵齡的成熟卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)受體對(duì)核移植有很大的影響。
卵母細(xì)胞快速而準(zhǔn)確地去核可避免孤雌發(fā)育,縮短體外操作時(shí)間,減少實(shí)驗(yàn)中的干擾因素。通常有以下幾種方法:活性熒光染料定位法、盲吸法、點(diǎn)壓法、化學(xué)誘導(dǎo)去核法及紡錘體探測(cè)技術(shù)。
注核一般分為胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射一般用Piezo-actuation(壓電-陶瓷系統(tǒng))微注射系統(tǒng),直接把供體核注入胞質(zhì)內(nèi);透明帶下注射則把整個(gè)供核細(xì)胞注射至卵周隙,并需要融合。當(dāng)然,Peura等采用與傳統(tǒng)顯微操作程序相反的方法,利用去除透明帶的綿羊卵母細(xì)胞,先融合外來(lái)核,然后再去掉卵母細(xì)胞核,獲得較好的結(jié)果,而且大大縮短了體外操作時(shí)間。
目前主要有3種激活方案,即融合前激活、融合同時(shí)激活及融合后激活。激活后的卵母細(xì)胞,MPF活性降低,不會(huì)使移入其中的細(xì)胞發(fā)生PCC,阻止了G2期供體染色體的再?gòu)?fù)制現(xiàn)象,而Gl期和S期供體核仍可繼續(xù)進(jìn)行正常DNA復(fù)制,因而處于Gl、S和G2期的供核細(xì)胞仍繼續(xù)原來(lái)的周期進(jìn)程,保持正常核型。
電融合是通過(guò)在短時(shí)間強(qiáng)電場(chǎng)的作用下,使細(xì)胞的雙層膜產(chǎn)生可逆性擊穿,當(dāng)這種擊穿發(fā)生在相鄰的細(xì)胞膜接觸區(qū)域時(shí),兩側(cè)的細(xì)胞膜瞬間接觸并融合。由于該方法重復(fù)性好、細(xì)胞毒性小、融合效果好,后來(lái)逐漸被廣大研究人員采納。將電融合應(yīng)用于胚胎細(xì)胞的融合,成為主要的融合方式。
克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同,關(guān)鍵是要保證移入胚胎的時(shí)期和受體母畜的生理周期一致,因?yàn)轶w外培養(yǎng)的核移植胚胎比體內(nèi)發(fā)育的胚胎相對(duì)滯后,如果核移植胚胎在體外培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)受體母畜進(jìn)行同期發(fā)情處理的時(shí)間要相對(duì)晚些,這樣才能夠保證與核移植胚胎的時(shí)期同步化。