齊旺梅 海日汗 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 010018

腸道相關(guān)淋巴組織由細(xì)胞因子以及相關(guān)淋巴組織（PP）構(gòu)成，其中PP也是我們慣稱的派伊爾結(jié)。腸道的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)器官派伊爾結(jié)(Peyer.s patches,PP)外表的濾泡連接上皮(FAE)具有一些特定的受體可以結(jié)合某些細(xì)菌[1]。本次實(shí)驗(yàn)主要研究乳酸菌黏附內(nèi)化于派伊爾結(jié)性能從而發(fā)揮免疫作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)派伊爾結(jié)是通過細(xì)菌的內(nèi)化吸附能力從而被誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫因子發(fā)揮免疫作用的。具體內(nèi)容如下。

1 材料和方法

1.1 材料

FITC(異硫氰酸熒光素)于Am resco采購；OVA（卵清蛋白）于 Hyclone采購；RPM I1640是由GIBCO公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基。用于TNF-A，IL-10，IL-12檢測的試劑為中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)采用的所有菌株均為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 方法

（1）培養(yǎng)乳酸菌

將保存在含甘油15%的細(xì)菌培養(yǎng)基中的乳酸菌菌株進(jìn)行活化（使用-70e的瓊脂培養(yǎng)基），之后將其進(jìn)行單株菌落分離培養(yǎng)在37e的液體培養(yǎng)基內(nèi)17h，進(jìn)行連續(xù)2次的轉(zhuǎn)接，使用4800r/m in的離心速度離心10m in，進(jìn)行菌株的收集。

（2）熒光標(biāo)記乳酸菌

把活細(xì)菌或處理過的細(xì)菌懸浮于100 mg Pm LFITC中 (溶解于PBS,pH7.3),37e暗處作用1 h,PBS洗四次,然后把細(xì)菌懸浮于PBS(109CFUPm L)[2]。

（3）制備體外派伊爾結(jié)

參照原雪琦、常桂芳等[3,4]的制備進(jìn)行方法總結(jié)：把6周齡健康KM種小鼠用乙醚麻醉,脫頸處死,取出小腸,用預(yù)冷的PBS（磷酸緩沖液）清洗內(nèi)容物,剪下派伊爾結(jié)段組織塊。

（4）測定乳酸菌內(nèi)化黏附于派伊爾結(jié)

將被熒光素標(biāo)記的乳酸菌按照菌株的不同放入96孔板的微孔，每個(gè)微孔內(nèi)放入4個(gè)派伊爾結(jié)組織塊（內(nèi)壁朝上）。于暗處37e的培養(yǎng)基進(jìn)行1小時(shí)的搖床培養(yǎng)。然后使用PBS進(jìn)行清洗，加入消化液，于70e培養(yǎng)基內(nèi)17小時(shí)，待組織塊耗盡，以PBS為空白對照，使用化學(xué)發(fā)光或熒光分析儀，分別在530nm發(fā)射光以及485nm激光波長的光下對熒光值進(jìn)行檢測。內(nèi)化黏附性為每克派伊爾結(jié)相對的熒光數(shù)值。

（5）測定細(xì)胞因子

按照TNF-A，IL-10，IL-12檢測試劑的說明書進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品要重復(fù)檢測。

（6）小鼠分組處理

實(shí)驗(yàn)采用的是6周齡的小鼠（KM種），隨機(jī)分成6個(gè)小組，每組10只。①為空白組：不進(jìn)行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。②為致敏空白組：進(jìn)行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。③致敏L.rhamnosusGG洗胃組：進(jìn)行OVA致敏處理，全程使用菌懸溶液洗胃。第④，⑤，⑥三組分別為致敏L.acidophilusFn037 L洗胃組，致敏plantarumFn008 L洗胃組，致敏caseiFn012洗胃組，其操作方法均與第③組相同。在實(shí)驗(yàn)3周后，脫臼處死小鼠，看小鼠糞便形狀，水樣球狀糞便就成功。

（7）測定小鼠腹腔巨噬cell的吞噬活性

在實(shí)驗(yàn)3周后，脫臼處死小鼠，使用PBS溶液取其腹腔滲出液，經(jīng)過與熒光標(biāo)記以及培養(yǎng)基的培養(yǎng)后，在530nm發(fā)射光以及485nm激光波長的光下，檢測熒光值。

（8）測定小鼠糞便中sIgA

實(shí)驗(yàn)3周后，對每只小鼠進(jìn)行糞便的新鮮收集并給予稱重，使用PBS稀釋后于溫室培養(yǎng)半個(gè)小時(shí)，混合離心，按照測定試劑說明書測定小鼠糞便中的sIgA。

（9）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行計(jì)算處理，并使用方差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌對派伊爾結(jié)的黏附性以及誘導(dǎo)細(xì)胞因子的數(shù)量比較

L.caseiFn012，L.plantarum Fn008，L.philusFn 037，L.rhamnosusGG對派伊爾結(jié)的內(nèi)化能力依次增強(qiáng)，但對派伊爾結(jié)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12，TNF-A和IL-10的能力相當(dāng)。

2.2 對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響

從結(jié)果來看，第②組小鼠腹腔巨噬cell吞噬活性顯著增強(qiáng)，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第③組進(jìn)一步顯著上升，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它菌株組除了第⑥組與空白組相比較也均有提升，且差異明顯，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而第⑥組與空白組無明顯差異（p＞0.05）。 具體見表 1。

表1 各組對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響比較

2.3 測定小鼠糞便中sIgA致敏可抑制小鼠對sIgA的分泌,乳酸菌則可增強(qiáng)小鼠對sIgA的分泌，第③，④，⑤三組均可削弱由于致敏導(dǎo)致的sIgA分泌下降情況，且效果顯著，p＜0.05（具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。第⑥組菌株無明顯作用，p＞0.05（不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。詳細(xì)見表2。

表2 各組對小鼠分泌sIgA的影響比較

3 結(jié)論

筆者通過此次研究得出，派伊爾結(jié)是通過細(xì)菌菌株的內(nèi)化黏附，被誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫細(xì)胞因子從而發(fā)揮其在腸道黏膜免疫中的作用，并且免疫因子分泌的多少與細(xì)菌菌株的內(nèi)化黏附能力成正比。這可為以后工作中對免疫調(diào)節(jié)性乳酸桿菌以及活菌疫苗載體的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

[1]Brayden DJ,Baird AW.Apical membrane receptors on intes-tinal M cells：potential targets for vaccine delivery [J].AdvDrug Deliv Rev,2004,56(6)：721-726.

[2] Vinderola CG,Medici M,Perdigon G.Relationship betweeninteraction sites in the gut,hydrophobicity, mucosal immuno -modulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria[J].J Appl M icrobiol,2004,96(2)：230-243.

[3]原雪琦,孫進(jìn),常桂芳,樂國偉,施用暉.10株乳酸菌黏附小鼠派伊爾結(jié)及免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(7)：577-580.

[4]常桂芳，施用暉，樂國鋒，孫進(jìn)，徐子偉，原雪琪，胡曉麗.乳酸菌內(nèi)化小鼠小腸派伊爾結(jié)特性及其影響因素[J].科技導(dǎo)報(bào)，2008，26（23）：65-69.