李書(shū)國(guó) 袁 濤 王麗然

（河北科技大學(xué)食品科學(xué)系，石家莊 050018）

油脂在貯存時(shí)會(huì)自動(dòng)氧化而酸敗變質(zhì)，進(jìn)而影響食品的質(zhì)量安全［1－2］。許多植物油中富含維生素E（生育酚），是天然的抗氧化劑，但高度精煉過(guò)的油脂會(huì)導(dǎo)致一部分VE損失，使得抗氧化性不足，需要另外添加合成抗氧化劑來(lái)延緩油脂氧化，目前油脂中最常用的是叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ），結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式如圖1所示。GB 2760—2011中規(guī)定THBQ限量為0．2 g／kg。油脂的氧化反應(yīng)，主要涉及自由基的連鎖反應(yīng)，而抗氧化劑屬于酚類物質(zhì)，可提供質(zhì)子并干擾或延滯連鎖反應(yīng)中自由基的增殖步驟，并自身形成穩(wěn)定的共振結(jié)構(gòu)而阻斷氧化，提高油脂的穩(wěn)定性［3－4］。

圖1 TBHQ和VE化學(xué)結(jié)構(gòu)式

油脂中抗氧化劑的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法法（GC）、薄層色譜法（TLC）、比色法、分光光度法等［5－6］（優(yōu)缺點(diǎn)如表 1所示），而電化學(xué)方法快速、靈敏、簡(jiǎn)便，測(cè)量精度高、選擇性好，預(yù)處理程序簡(jiǎn)單，樣品分析所需時(shí)間短，成本低，便于在線檢測(cè)?？寡趸瘎┰隗w內(nèi)通過(guò)電子轉(zhuǎn)移來(lái)清除氧自由基的過(guò)程類似于在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可通過(guò)電化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)［7－8］。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者將該法用于油脂中抗氧化劑的定量分析研究，并認(rèn)為該法甚至可替代高效液相色譜法，但是將天然抗氧化劑和合成抗氧化劑共同進(jìn)行研究的報(bào)道很少。Marie Coatanea等［9］采用差分脈沖伏安法用超微電極檢測(cè)植物油和動(dòng)物油脂中的VE。Thiago F．Tormin等［10］在含有 50 mmol／L HCLO4的 75%乙醇－水電解質(zhì)溶液中以玻碳電極為工作電極，多脈沖電流分析法對(duì)生物柴油中的TBHQ直接進(jìn)行安培檢測(cè)，方法快速、精確，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Tatiane Alfonso de Araujo等［11］選用滴貢電極以方波伏安法對(duì)大豆生物柴油中的TBHQ進(jìn)行測(cè)定，支持電解質(zhì)為pH7．0的BR緩沖液與甲醇的混合液，并添加表面活性劑Triton X－100以增加信號(hào)響應(yīng)，較HPLC法檢測(cè)時(shí)間短、成本低。

表1 幾種抗氧化劑檢測(cè)方法的特點(diǎn)對(duì)比

本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在有機(jī)相中以循環(huán)伏安法研究了人工合成抗氧化劑TBHQ及天然抗氧化劑VE在玻碳電極上的反應(yīng)過(guò)程與氧化機(jī)理，優(yōu)化電化學(xué)法測(cè)定兩種抗氧化劑的試驗(yàn)條件，考查兩種抗氧化劑電分析信號(hào)與其濃度之間的關(guān)系，驗(yàn)證電分析法測(cè)定該2種抗氧化劑在油脂中的抗氧化效果。

1 材料與方法

1．1 試劑與材料

特丁基對(duì)苯二酚（THBQ）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生育酚：Alfa公司；硫酸、95%乙醇、36%乙酸、無(wú)水乙醇、乙醚、抗壞血酸、氫氧化鉀：天津市百世化工有限公司；1，4－二氧六環(huán)、乙腈、異丙醇、無(wú)水氯化鋰：天津市博迪化工有限公司；上述試劑均為分析純；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；電極預(yù)處理所用硫酸溶液用三蒸水配制，其余溶液均用無(wú)水乙醇配制；大豆油、玉米油、葵花籽油：市售。

1．2 儀器與設(shè)備

LK98BⅡ型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)：天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；三電極系統(tǒng)（3 mm玻碳圓盤(pán)電極為工作電極、鉑絲電極為對(duì)電極、Ag／AgCl電極為參比電極）、電解杯：上海CHI儀器公司；FA2204型電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；Dragon MED型微量移液器：大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司；TGL－10B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LC－10A型液相色譜儀（配置RF－10A波長(zhǎng)可變的熒光檢測(cè)器，SIL－10A自動(dòng)進(jìn)樣器）：日本島津公司。

固定相：A Nova pak C18（4μm，15 cm ×4．6 mm）大連中國(guó)色譜中心；流動(dòng)相為甲醇與水（98∶2），流速為0．8 mL／min，進(jìn)樣量為 3μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)325 nm；色譜圖由島津C－R7A型記錄儀記錄。

1．3 電化學(xué)試驗(yàn)方法

1．3．1 電極的預(yù)處理

玻碳電極在測(cè)定前依次用 1．0μm、0．3μm、0．05μm Al2O3粉拋光成鏡面，用大量蒸餾水沖洗，再分別用丙酮、蒸餾水各超聲清洗2分鐘，除去表面吸附物。然后置于0．2 mol／L硫酸溶液中用循環(huán)伏安法掃描約10 min，掃描速度為50 mV／s，電壓范圍為－0．5～1．5 V，得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖后，取出，用蒸餾水洗凈，室溫干燥后備用。每次測(cè)定之后，均對(duì)電極進(jìn)行拋光處理后再進(jìn)行下一次的測(cè)定。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用無(wú)水乙醇分別配制濃度為1．0×10－2mol／L的VE和TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液，棕色試劑瓶中避光貯存?zhèn)溆?，同時(shí)配制1．0 mol／L硫酸的乙醇溶液和 0．2 mol／L氯化鋰的乙醇溶液。在10 mL電解杯中加入適量體積的1，4－二氧六環(huán)和乙腈，使二者體積比為3∶1；再用微量移液器取適量氯化鋰、硫酸、TBHQ及VE注入電解杯中，分別使其濃度達(dá) 3．0×10－2、6．0×10－3、2．0×10－4、2．0×10－4mol／L。將三電極插入電解杯中，通氮除氧5 min，用電化學(xué)分析儀記錄其伏安曲線并優(yōu)化分析試驗(yàn)條件。

1．3．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

在空白樣和加入標(biāo)準(zhǔn)TBHQ、VE溶液樣品中，以差分脈沖伏安法分別測(cè)量并記錄其氧化峰電流響應(yīng)，平行測(cè)定3次，取平均值作為T(mén)BHQ、VE氧化峰電流值，考察氧化峰電流值與抗氧化劑濃度之間的關(guān)系。所有試驗(yàn)均在室溫下于氮?dú)夥諊羞M(jìn)行測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2．1 TBHQ與VE的電化學(xué)行為和電極反應(yīng)過(guò)程

在含0．03 mol／L氯化鋰、6 mmol／L硫酸、1，4－二氧六環(huán) －乙腈（3∶1，V／V）的支持電解質(zhì)溶液中，使TBHQ和VE最終濃度為2×10－4mol／L，以玻碳電極為工作電極，Ag／AgCl電極為參比電極，Pt電極為對(duì)電極，通過(guò)對(duì)TBHQ和VE進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄i－E曲線圖（如圖2所示），對(duì)其電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。其中，電位掃描范圍為1．0～0．2 V，掃描速度為50 mV／s，等待時(shí)間為 1 s。

圖2 TBHQ和VE在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖

由圖2可以看出，TBHQ和VE均只有氧化峰，沒(méi)有還原峰，說(shuō)明在此種條件下，二者的電化學(xué)性質(zhì)是不可逆的，氧化峰電位分別為800 mV和640 mV；依據(jù)不同電位掃描速度下的循環(huán)伏安圖，二者氧化峰電流值與掃描速度平方根成線性關(guān)系，IpTBHQ＝0．088v1／2－0．169（r＝0．982 0），IpVE＝0．221 7v1／2－0．272 3（r＝0．982 8），且說(shuō)明這 2種抗氧化劑電化學(xué)氧化過(guò)程屬典型擴(kuò)散控制過(guò)程。掃描過(guò)程中，氧化峰電位會(huì)隨掃速和抗氧化劑濃度的增加向正電位方向偏移（如圖3所示掃描速度及抗氧化劑濃度增加對(duì)TBHQ氧化峰電位的影響，VE與TBHQ類似，省略）?？寡趸瘎┭趸咫娢恢等Q于該化合物氧化還原性質(zhì)，反映供給電極電子的能力和該物質(zhì)的電化學(xué)活性。電位值越低，越易失去電子而被氧化，抗氧化活性越強(qiáng)。2種抗氧化劑均是向電極提供氫原子而本身形成相對(duì)穩(wěn)定的醌達(dá)到抗氧化的效果，如圖4所示。VE的出峰位置低于TBHQ，說(shuō)明抗氧化效果較好，且VE只有一個(gè)氧化峰出現(xiàn)，因此該法所得的結(jié)果是植物油中VE的總和，不能區(qū)分其各個(gè)異構(gòu)體。

圖3 掃描速度及抗氧化劑濃度增加對(duì)氧化峰電位的影響

圖4 TBHQ及VE在玻碳電極上的氧化機(jī)理

2．2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2．2．1 有機(jī)溶劑的選擇

TBHQ和VE均為脂溶性抗氧化劑，必須溶于有機(jī)溶劑中，選擇合適的有機(jī)溶劑對(duì)電化學(xué)方法測(cè)定該抗氧化劑非常關(guān)鍵。植物油疏水性較強(qiáng)，若單純選用甲醇和乙腈等極性較大的溶劑，如乙腈介電常數(shù)為38．8，油樣很難被溶解，溶液混濁，且有油滴懸??；而氯仿和1，4－二氧六環(huán)均可以增加油樣溶解度，使得溶液澄清透明，但二者的介電常數(shù)都很小，氯仿為5．1，二氧六環(huán)為2．21，介電常數(shù)小的溶劑導(dǎo)電性不強(qiáng)，響應(yīng)電流也不理想，且氯仿低毒。另外所選溶劑必須對(duì)植物油樣品有足夠的溶解度，溶液均一透明，且能溶解所選的支持電解質(zhì)，以獲得良好的導(dǎo)電性，同時(shí)溶劑黏度應(yīng)盡量低，以便保證離子快速向電極遷移。

綜上所述，選取1，4－二氧六環(huán)與乙腈混合溶液做有機(jī)溶劑，且體積比為3∶1時(shí)，可以很好地溶解0．5 g植物油樣品。并且在0．05 mol／L氯化鋰做支持電解質(zhì)時(shí)，濃度為2×10－4mol／L的TBHQ在幾種不同溶劑中的循環(huán)伏安圖（如圖5所示）表明在1，4－二氧六環(huán) －乙腈 －氯化鋰（3∶1∶6，V／V／V）混合溶劑中所得的TBHQ循環(huán)伏安圖峰形最好，電流響應(yīng)最大。

圖5 TBHQ在不同溶劑中的循環(huán)伏安圖

2．2．2 支持電解質(zhì)的選擇

在有機(jī)溶劑中，支持電解質(zhì)必須以離子狀態(tài)存在，所以一般使用離子傾向性大的陰離子和陽(yáng)離子，目的是為了增強(qiáng)溶液的導(dǎo)電性，降低有機(jī)溶劑的電阻，減小或消除電遷移電流。支持電解質(zhì)需要滿足以下條件：（1）在所研究的溶劑中有足夠的溶解度；（2）不發(fā)生氧化還原反應(yīng)，且有較寬的電位窗口；（3）本身不發(fā)生電極反應(yīng)，不會(huì)對(duì)電極反應(yīng)產(chǎn)生干擾；（4）價(jià)格低廉，容易購(gòu)得；（5）毒性和危險(xiǎn)性較小。

在本試驗(yàn)中比較高氯酸鋰和氯化鋰對(duì)抗氧化劑的伏安電流響應(yīng)，選用響應(yīng)信號(hào)高的氯化鋰作為支持電解質(zhì)。配制一系列濃度的氯化鋰乙醇溶液，在選定的有機(jī)溶劑中，以VE為例分別于上述濃度下對(duì)其進(jìn)行循環(huán)伏安法測(cè)定，如圖6所示，結(jié)果顯示較大濃度的氯化鋰響應(yīng)電流會(huì)相對(duì)減小，并且峰電位會(huì)略微正移。而0．03 mol／L的氯化鋰會(huì)得到更大的電流響應(yīng)，并且峰形良好，因此選用0．03 mol／L乙醇氯化鋰做支持電解質(zhì)。

圖6 支持電解質(zhì)濃度對(duì)VE的氧化峰電流的影響

2．2．3 硫酸濃度的選擇

H＋在抗氧化劑的氧化中起到一定的作用，因此硫酸的乙醇溶液用來(lái)調(diào)整有機(jī)相的pH值，但由于有機(jī)溶劑中的pH不能用常規(guī)值表示，所以用硫酸溶液的濃度來(lái)表示，并利用循環(huán)伏安法研究其對(duì)抗氧化劑TBHQ和VE電化學(xué)行為的影響，如圖7所示。以2×10－4mol／L VE為例，由圖7可知氧化峰峰電流在硫酸濃度為6 mmol／L時(shí)達(dá)到最大值，然后基本保持不變。因此本研究選擇濃度6 mmol／L的硫酸乙醇溶液用于進(jìn)一步的研究。

圖7 不同硫酸濃度對(duì)VE的氧化峰電流的影響

2．2．4 電參數(shù)的選擇

微分脈沖伏安法能有效降低背景電流，具有較高精確度和靈敏度，因此選擇微分脈沖技術(shù)對(duì)TBHQ和VE進(jìn)行檢測(cè)分析。TBHQ和VE的微分脈沖伏安圖如圖8所示，試驗(yàn)條件為前述所定試驗(yàn)條件。電位范圍為1．0～0．2 V、脈沖幅度為80 mV、電位增量為1 mV、脈沖寬度為0．3 s、脈沖間隔為0．05 s時(shí)，二者氧化峰電流響應(yīng)最好，峰形尖銳，可有效降低二者之間的氧化峰重疊程度，擴(kuò)大電位差。

綜上所述，最終確定的最佳電化學(xué)分析參數(shù)如下：1，4－二氧六環(huán) －乙腈（3∶1；V／V）為最宜有機(jī)溶劑；0．03 mol／L乙醇氯化鋰為最宜支持電解質(zhì)，乙醇硫酸濃度為6 mmol／L，脈沖幅度為80 mV，脈沖寬度為0．3 s，脈沖間隔0．05 s。在該參數(shù)下，2種抗氧化劑的峰形良好，電位差較大，可獲得較高的靈敏度。但是盡管二者峰形良好，仍有些許重疊，因此采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法處理，減少或消除分析物間的相互干擾，提高分析測(cè)量的精確度與選擇性。

圖8 TBHQ和VE的微分脈沖伏安圖

2．3 THBQ和VE的線性回歸方程

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別制備TBHQ和VE不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品。在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，分別記錄TBHQ和VE在裸玻碳電極上的差分脈沖伏安圖，得到其氧化峰電流值（Ip）與其對(duì)應(yīng)濃度（c）的線性校正模型，如表2所示，同時(shí)表2列出靈敏度、檢測(cè)限、相關(guān)系數(shù)及線性范圍等。

表2 抗氧化劑氧化峰電流值與濃度關(guān)系

2．4 電化學(xué)法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)預(yù)測(cè)混合樣品中的抗氧化劑

偏最小二乘法（partial least squares regression，PLS）是一種基于因子分析的多變量校正方法。該方法同時(shí)對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)矩陣和濃度組成矩陣進(jìn)行主成分分解，以它們的主因子進(jìn)行回歸，可改善多組分同時(shí)測(cè)定的準(zhǔn)確度和可靠性［12］。本試驗(yàn)將電化學(xué)方法與偏最小二乘法相結(jié)合，預(yù)測(cè)模擬混合樣品中的抗氧化劑濃度，分離重疊波譜。

在本研究中，校正組采用正交設(shè)計(jì)L9（34），配制9組不同濃度的抗氧化劑混合溶液，以差分脈沖法依次記錄每個(gè)混合溶液的氧化峰電流值（測(cè)量3次取平均值），所得測(cè)定數(shù)據(jù)根據(jù)偏最小二乘法建立校正模型，見(jiàn)表3。數(shù)學(xué)模型建立目的是為了未知樣本的預(yù)測(cè)，選取5組混合溶液作為預(yù)測(cè)組，預(yù)測(cè)結(jié)果如表4。

表3 TBHQ和VE校正組濃度組成

表4 PLS法對(duì)預(yù)測(cè)組濃度的預(yù)報(bào)結(jié)果

2．5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用差分脈沖伏安法（DPV）與PLS方法相結(jié)合測(cè)定3種市購(gòu)植物油樣品（大豆油、葵花籽油及玉米油）中所含的抗氧化劑（所測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5）。目前在油脂中較常用的合成抗氧化劑是THBQ，在葵花籽油與玉米油中均未檢出TBHQ，只檢出天然抗氧化劑VE，說(shuō)明這2種植物油所含的生育酚含量較高，使得油脂較穩(wěn)定，不需額外添加合成抗氧化劑便可達(dá)到抗氧化的目的，且可從表5中看出玉米油中所含的生育酚含量要高于葵花籽油。而大豆油中只檢測(cè)到了TBHQ，沒(méi)有檢測(cè)出VE，說(shuō)明大豆油中不含VE或所含的生育酚的量極少。在檢測(cè)中，DPV法與PLS法結(jié)合測(cè)定植物油樣品回收率在97．7%～104．2%范圍內(nèi)，并且為了驗(yàn)證該方法的可行性，用HLPC方法（VE按照 NY／T 1598—2008進(jìn)行測(cè)定，TBHQ按照GB／T 21512—2008進(jìn)行測(cè)定）分析同一樣品，結(jié)果與DPV法基本一致（結(jié)果見(jiàn)表6）。因此這種方法是可行的，且可省去各種繁瑣的預(yù)處理步驟，使得操作簡(jiǎn)便，精確，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

表5 DPV法與PLS法聯(lián)用對(duì)實(shí)際油樣中標(biāo)準(zhǔn)加入回收的預(yù)測(cè)結(jié)果

表6 DPV法與HLPC法對(duì)相同質(zhì)量油樣中抗氧化劑含量的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

3．1 合成抗氧化劑TBHQ與天然抗氧化劑VE均在裸玻碳電極上表現(xiàn)出不可逆的性質(zhì)，且屬于典型擴(kuò)散控制過(guò)程。二者的循環(huán)伏安圖表明TBHQ的氧化峰電位高于VE，而氧化峰電位表明給予電極電子的能力，電位越低，表明越易失去電子，即越易在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，抗氧化活性越強(qiáng)。因此天然抗氧化劑VE的抗氧化活性強(qiáng)于合成抗氧化劑TBHQ。

3．2 確定電化學(xué)法測(cè)定兩種抗氧化劑的最佳試驗(yàn)條件：1，4－二氧六環(huán) －乙腈（3∶1，V／V）作為有機(jī)溶劑溶解支持電解質(zhì)及植物油樣品，0．03 mol／L氯化鋰溶液為支持電解質(zhì)，6 mmol／L硫酸溶液調(diào)節(jié)電解質(zhì)溶液的pH值，利用差分脈沖伏安法確定2種抗氧化劑的氧化峰電流與濃度之間的線性回歸方程、線性檢測(cè)范圍及最低檢測(cè)限等。

3．3 在有機(jī)相中采用電化學(xué)分析法測(cè)定實(shí)際油樣中的抗氧化劑，不需對(duì)油樣進(jìn)行提取、分離、純化等復(fù)雜的前處理，且與PLS法相結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，可有效消除兩種抗氧化劑間的相互影響。該法分析所得抗氧化劑VE與TBHQ的含量與HPLC法所測(cè)定的VE與THBQ含量一致性良好，表明電化學(xué)分析法測(cè)定植物油中的合成抗氧化劑TBHQ與天然抗氧化劑VE是可行的，并且操作簡(jiǎn)便，樣品無(wú)需預(yù)處理，測(cè)定結(jié)果精確。

［1］彭輝．油脂、含油食品的氧化、抗氧化以及抗氧化劑［J］．食品工業(yè)，2004（3）：34－36

［2］翁新楚．抗氧化劑及其抗氧化機(jī)制［J］．鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)，1993（3）：20－29

［3］賈繼紅，盛佳坤．天然抗氧化劑及其在食品中的應(yīng)用［J］．化學(xué)工程師，2004（7）：46－47

［4］Yasukazu O，Tetsuto K，Yuji Arai．Antioxidant activities of tocopherols［J］．Polymer Degradation and Stability，2001（72）：302－311

［5］李書(shū)國(guó)，薛文通，陳輝，等．電分析法測(cè)定植物油中抗氧化劑研究［J］．糧食與油脂，2009（6）：39－43

［6］尹淑濤，薛文通，張惠，等．油脂中合成抗氧化劑檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)油脂，2009（6）：75－79

［7］何建波，徐紅梅，朱燕舞，等．電化學(xué)方法研究天然抗氧化劑［J］．化學(xué)與生物工程，2004（5）：10－12

［8］李鉉軍，崔勝云．電化學(xué)分析法在天然抗氧化劑中的應(yīng)用和展望［J］．延邊大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，35（2）：151－155

［9］Coatanea M，Darchen A，Hauchard D．Electroanalysis at ultramicroelectrodes of oils and fats application to the determination of vitamin E［J］．Sensors and Actuators B，2001（76）：539－544

［10］Thiago F T，Denise T G，Leandro G S，et al．Direct amperometric determination of tert－butylhydroquinone in biodiesel［J］．Talanta，2010（82）：1599－1603

［11］Araujo T，Barbosa A，Viana L，et al．Electroanalytical determination of TBHQ ，a synthetic antioxidant，in soybean biodiesel samples［J］．Fuel，2011（90）：707－712

［12］倪永年，黃春芳．化學(xué)計(jì)量學(xué)在食品分析中的應(yīng)用與進(jìn)展［J］．食品科學(xué)，2003，24（2）：154－157．