王曉琴

（華僑大學(xué)，廈門 361021）

茶（Camellia sinensisO．Ktze）是山茶屬（Camellia）植物，其同屬近緣種油茶、山茶花均為油料作物。茶葉籽含油率18%～30%，另含有約10%的茶皂素、豐富的淀粉、蛋白質(zhì)和可溶性糖，同時(shí)含有茶多酚、生育酚（VE）等成分［1－3］，我國(guó)衛(wèi)生部 2009年發(fā)布第18號(hào)公告批準(zhǔn)茶葉籽油等7種物品為新資源食品。然而在茶業(yè)生產(chǎn)中茶葉籽作為生產(chǎn)廢料并未廣泛開(kāi)發(fā)，大量資源被焚燒或廢棄。我國(guó)作為茶葉大國(guó)，茶葉籽資源開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景不可估量［4］。

水酶法是一種較為先進(jìn)的油脂提取技術(shù)，具有“安全、高效、綠色”等特點(diǎn)，滿足食用油生產(chǎn)要求，在菜籽、橄欖、葡萄籽、玉米胚芽、油茶等油料作物上均見(jiàn)開(kāi)展研究［5－9］，尤其在花生、核桃油脂及蛋白綜合提取表現(xiàn)出獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)［10－11］。在油脂提取過(guò)程中中性蛋白酶具有減輕乳化程度及避免調(diào)節(jié)pH影響油脂品質(zhì)等優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)采用中性蛋白酶對(duì)茶葉籽油提取工藝進(jìn)行探索，并探索廢棄液中副產(chǎn)物茶皂素得率，旨在為茶葉籽綜合開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

鐵觀音茶葉籽：安溪茶葉科學(xué)研究所。

中性蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醚、硫酸：國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；香蘭素、香草醛：阿拉丁公司。

DF－Ⅰ集熱式磁力攪拌器：江蘇省榮華儀器制造有限公司；RE52CS旋蒸蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Ⅴ－1200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 提取工藝流程

茶葉籽→干燥→去殼→脫衣→粉碎→稱量→滅酶→冷卻→酶解→二次滅酶→離心→分液

1．2．2 單因素試驗(yàn)

在料液比為1∶4（g∶mL）、酶解溫度為 45℃條件下酶解2．5 h，考察1、4、7、10、13 mL酶溶液（0．4%）對(duì)出油率的影響，同時(shí)對(duì)提取工藝副產(chǎn)物茶皂素得率進(jìn)行測(cè)定；

在酶用量7 mL、酶解溫度為45℃條件下酶解2．5 h，考察料液比（g∶mL）1∶2、1∶3、1∶4、1∶5及 1∶6對(duì)出油率的影響，同時(shí)對(duì)提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進(jìn)行測(cè)定；

在酶用量7 mL、料液比為1：4酶解2．5 h條件下，考察酶解溫度 30、37．5、45、52．5、60℃（因儀器條件限制，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中溫度涉及小數(shù)均在操作過(guò)程中依據(jù)四舍五入原則取整處理）對(duì)出油率的影響，同時(shí)對(duì)提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進(jìn)行測(cè)定。

在酶用量7 mL、料液比為1∶4、酶解溫度為45℃條件下，考察酶解時(shí)間 0．5、1．5、2．5、3．5、4．5 h對(duì)出油率的影響，同時(shí)對(duì)提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進(jìn)行測(cè)定。

1．2．3 中心組合試驗(yàn)

根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)因素與水平，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1．2．4 測(cè)定方法

茶皂素測(cè)定采用香草醛一硫酸法［12］。

式中：c為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由吸光度計(jì)算出此時(shí)茶皂素的濃度／mol／L；V為測(cè)定時(shí)吸取的體積數(shù)；N為稀釋倍數(shù)；m為被測(cè)樣品質(zhì)量／g。

1．2．5 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2007和Design Expert 7．0。

2 結(jié)果與討論

2．1 酶用量對(duì)茶葉籽油及其茶皂素得率的影響

中性蛋白酶可降解脂蛋白，從而將油脂從復(fù)合體中釋放出來(lái)［8］。圖1表明隨著酶用量的增加，油得率也隨之增加。添加10 mL酶溶液時(shí)油得率達(dá)到最大值為21．6%，此時(shí)油脂提取率達(dá)到70．57%，繼續(xù)增大酶使用量出油率略微減小；對(duì)于茶皂素的浸出，添加1～10 mL酶溶液茶皂素浸出量隨酶量增加而增加，當(dāng)酶量為底物的10 mL時(shí)達(dá)到峰值5．7%，但在整個(gè)范圍里茶皂素的浸出量變化不大?？梢?jiàn)添加10 mL酶溶液是中性蛋白酶提取油脂最適酶用量。

圖1 酶用量對(duì)出油率和茶皂素浸出量的影響

2．2 酶解溫度對(duì)茶葉籽油及茶皂素得率的影響

溫度是影響酶促反應(yīng)速率的主要因素，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高物質(zhì)活化能增大，酶促反應(yīng)加快；溫度過(guò)高可能導(dǎo)致酶活性下降甚至失活［13］。由圖2可知：在30℃至52．5℃的范圍里，隨著溫度升高油得率增大，反應(yīng)溫度為52．5℃時(shí)茶葉籽油得率達(dá)到峰值，此時(shí)油得率達(dá)到了22．6%，之后隨著反應(yīng)溫度進(jìn)一步加大油得率下降；而對(duì)于茶皂素在此研究條件下，隨著溫度升高浸出量不斷增大，溫度對(duì)其溶解度的正向影響可能是原因之一。由此可得，水酶法提取茶葉籽油最適溫度是52．5℃；對(duì)于茶皂素的浸出研究，此試驗(yàn)沒(méi)有峰值，在此試驗(yàn)研究條件下茶皂素的浸出量隨著溫度的增大而增大。

圖2 酶解溫度對(duì)出油率和茶皂素浸出量的影響

2．3 料液比對(duì)茶葉籽油及茶皂素得率的影響

料液比通過(guò)影響酶與底物接觸機(jī)會(huì)來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)速度［13］，對(duì)出油率和茶皂素得率影響見(jiàn)圖3。隨著料液比增大油得率逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶5油得率最高，此時(shí)出油率達(dá)到22．0%，之后隨著料液比進(jìn)一步加大，油得率下降；在1∶2至1∶6范圍內(nèi)，隨著料液比增大可能促進(jìn)溶解度增大，茶皂素得率從而一直保持增大趨勢(shì)?？梢?jiàn)，茶葉籽油提取最適料液比為1∶5；對(duì)于茶皂素的浸出研究，若要得到更大的浸出量，則應(yīng)該考慮進(jìn)一步加大料液比。

圖3 料液比對(duì)油得率和茶皂素得率的影響

2．4 酶解時(shí)間對(duì)茶葉籽油及茶皂素得率的影響

從圖4可見(jiàn)，酶解時(shí)間0．5～3．5 h內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)酶促反應(yīng)較為充分，油得率逐漸增加；在3．5 h時(shí)出油率最高，出油率達(dá)到21．5%；3．5 h后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間油得率逐漸降低，而茶皂素得率隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加。因此，提取茶葉籽油最適反應(yīng)時(shí)間為3．5 h，對(duì)于茶皂素提取研究此試驗(yàn)沒(méi)有峰值，所以還需進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到較大的茶皂素浸出量。

圖4 時(shí)間對(duì)出油率和茶皂素浸出量的影響

2．5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型方程：Y＝－65．950＋3．011X1＋1．522X2＋10．167X3＋5．685X4＋0．167X1X3－0．108X1X4＋0．043 3X2X4－0．300X3X4－0．166X12－0．0157X22－1．059X32－0．797X42，模擬的可靠性可通過(guò)方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察，見(jiàn)表3。

表2 水酶法提取茶葉籽油響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

續(xù)表

表3為回歸分析結(jié)果，當(dāng)“P＞F”值小于0．05時(shí)，即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著。從結(jié)果可以看出：F回歸＝25．46，P＜0．000 1，表明二次多元回歸模型極其顯著；F失擬＝2．71，失擬項(xiàng)P＝0．174 1＞0．05，表明模擬失擬度不顯著；并且該模型的調(diào)整確定系數(shù)R2＝0．950 2，說(shuō)明該模型能解釋95．02%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小。因此，可以用此模型對(duì)茶葉籽油提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)X1、交叉項(xiàng)X1X3、及二次項(xiàng)對(duì)茶籽油提取率的曲面效應(yīng)極為顯著，X1X4、X2X4顯著，說(shuō)明它們對(duì)響應(yīng)值影響極大，且所考察因素對(duì)響應(yīng)值影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。

表3 回歸系數(shù)取值及分析結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳點(diǎn)的取值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零數(shù)并整理得：

0＝3．011＋0．167X3－0．108X4－0．332X1

0＝1．522＋0．043 3X4－0．031X2

0＝10．167＋0．167X－0．300X－2．118X2143

0＝5．685－0．108X1＋0．043X2－0．300X3－1．593X4

求解方程得到最佳優(yōu)化提取條件：酶量10．83 mL，溫度52．96℃，料液比1∶5．19，反應(yīng)時(shí)間3．30 h，由回歸方程預(yù)測(cè)在此條件下茶籽油得率的理論值為25．926%。結(jié)合試驗(yàn)條件采用酶量10．83 mL、溫度53℃、料液比1∶5．19、反應(yīng)時(shí)間 3．30 h開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)，茶葉籽油得率分別為 26．075%、26．094%、25．990%，平均值為26．053%，與理論預(yù)測(cè)值接近且相對(duì)誤差僅為0．5%，表明此模型對(duì)茶葉籽油提取條件參數(shù)優(yōu)化可行。單因素試驗(yàn)表明油脂提取廢棄液可用于開(kāi)發(fā)茶皂素，但由于二者最優(yōu)工藝不一致，中心復(fù)合試驗(yàn)僅考察出油率。

3 討論與結(jié)論

本研究采用中性蛋白酶開(kāi)展茶葉籽油提取研究，建立了油得率與工藝條件參數(shù)間的數(shù)學(xué)模型：Y＝－65．950＋3．011X1＋1．522X2＋10．167X3＋5．685X4＋0．167X1X3－0．108X1X4＋0．043 3X2X4－0．300X3X4－0．166X12－0．0157X22－1．059X32－0．797X42，優(yōu)化工藝條件結(jié)果為酶量10．83 mL、溫度53℃、料液比1∶5．19、反應(yīng)時(shí)間 3．30 h，出油率可達(dá)26．083%，為科學(xué)開(kāi)展復(fù)合酶后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本文揭示油脂提取廢液可用于開(kāi)發(fā)副產(chǎn)物茶皂素，為茶葉籽綜合開(kāi)發(fā)提供了新思路。

中性蛋白酶通過(guò)降解肽鍵將油脂從蛋白質(zhì)束縛中解放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)油脂提取效果。茶籽中蛋白質(zhì)具有乳化作用，在油脂提取過(guò)程中阻礙了油水兩相分離，降低了油脂提取率。中性蛋白酶降解蛋白質(zhì)，具有一定破乳效果，與果膠酶等水解酶相比，油脂提取過(guò)程中乳化現(xiàn)象得到緩解，另外具有成本較低、免調(diào)pH等優(yōu)勢(shì)，在水酶法提取油脂中具有較大的應(yīng)用潛力。

志謝：在本試驗(yàn)工作中，劉慶偉、林克利同學(xué)付出了大量的努力，在此一并致謝！

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