周 亮，吳 佳，劉 剛，楊則宜

（1.湖南科技大學(xué)體育學(xué)院，湘潭411201；2.國家體育總局運動營養(yǎng)研究所，北京100029）

運動改善心血管健康的機(jī)制在于運動增加機(jī)體血流速度，升高血管內(nèi)皮的剪切應(yīng)力，并上調(diào)一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放，但是其機(jī)制和信號通路尚不明確［1］。AMP激活蛋白激酶（5-AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種運動敏感分子，最新研究成果表明［2］，AMPK可能激活 eNOS在 Ser1179位的磷酸化、并促進(jìn)NOS與Hsp90的結(jié)合而提高其活性，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO釋放量，提示AMPK可能是運動改善血管內(nèi)皮功能的重要信號分子，但是尚未見運動對血管內(nèi)皮的AMPK激活的研究報道。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

6～8周齡Wistar（購于中南大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物學(xué)部），雄性，飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的“西方類型膳食”飼料，經(jīng)過動物模型檢驗，確定動脈粥樣硬化形成后，隨機(jī)分組。室溫20～24℃，自然光照，自由飲食、飲水，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于正式實驗。

1.2 動物分組

于動物模型建立實驗前，隨機(jī)選取12只為C組（正常對照組），未進(jìn)行動物建模。42只大鼠用于AS建模，其中6只在建模開始6周后用于模型檢驗，其余建模成功大鼠隨機(jī)分為3組，AS組（動脈粥樣硬化模型組）、ASL組（動脈粥樣硬化＋低強(qiáng)度有氧運動）、ASH組（動脈粥樣硬化＋高強(qiáng)度有氧運動），每組各12只。

1.3 動物模型的建立

42只大鼠進(jìn)行動物建模，依照溫進(jìn)坤等研究［3］，給予 AS、ASL和 ASH組高脂飼料，高脂飼料配方：大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料中加1%膽固醇，0.35%膽酸鈉，5%豬油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前 3 d按 7×105IU／kg的總劑量分3次灌胃給予維生素D3。動物建模時間為6周，6周后進(jìn)行動物模型檢驗。

1.4 有氧訓(xùn)練安排

據(jù)Fernando等的研究［4］，參考已有的文獻(xiàn)中有關(guān)大鼠的運動量范圍，各組大鼠適應(yīng)性運動3 d，開始正式運動干預(yù)；起始強(qiáng)度10m／min，小強(qiáng)度每周遞增1m／min，直至設(shè)定的運動組靶強(qiáng)度為13 m／min，0°坡度；大強(qiáng)度運動組每周遞增2 m／min至靶強(qiáng)度22m／min，每周遞增 1°坡度，直至靶坡度 8°。運動干預(yù)持續(xù)14周，每周5次，每次60min。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物模型檢驗 建模6周后隨機(jī)抽取6只建模大鼠和2只正常對照大鼠處死，取胸主動脈上段5mm放入3%戊二醛固定液中前固定、磷酸鹽緩沖液漂洗、1%鋨酸后固定、脫水、浸透、包埋、切片、電子染色后觀察。

1.5.2 血清取材檢測 建模結(jié)束后各運動組大鼠進(jìn)行運動訓(xùn)練6周，對照組保持正常飲食，禁食1 d，用戊巴比妥鈉腹腔麻醉、宰殺，腹主動脈取血。血液提取后靜置 30min，3 000 r／min離心 10min，分離血清。采用放射免疫法測定炎性因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），ELISA法測定 C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP），按試劑盒步驟操作。

1.5.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞收集 氯胺酮麻醉，入腹后自左側(cè)髂總動脈向心側(cè)插入大隱靜脈導(dǎo)管，注射肝素50 U，從髂總血管根部向上游離腹主動脈至主動脈弓下方，結(jié)扎切斷各分支；剪開右髂總動脈根部灌洗至流出液清亮后，于髂總動脈根部、主動脈弓下方結(jié)扎切斷，放于4℃含肝素抗生素鹽水（肝素105 U／L，青霉素4×1013U／L）內(nèi)運至細(xì)胞培養(yǎng)室；在750ml／L乙醇內(nèi)浸泡5min后移入超凈臺，剪去血管兩端，以4℃含肝素抗生素鹽水沖洗管腔和外膜后，注入37℃預(yù)熱的10 g／L膠原酶至另一端處可見灌入液為止，以無創(chuàng)血管夾夾閉兩端，置于37℃無菌肝素抗生素鹽水內(nèi)；5 min后剪去一端收集消化液，并以Hanks液沖洗，加入離心管，以1 000 r／min離心 5 min，收集細(xì)胞。

1.5.4 Western blot印跡法 大鼠內(nèi)皮細(xì)胞收集蛋白量不夠，合并同組的3只大鼠內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行AMPK的蛋白質(zhì)分析。處理后的各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入細(xì)胞裂解液5 min，于12 000 r／min，低溫離心15 min，BCA法檢測總蛋白量，每樣品取20μg上樣，SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，100 V恒壓維持通電80 min。TBS漂洗。室溫封閉1 h。加一抗（1∶1 000稀釋），4℃過夜孵育。HRP標(biāo)記的特異性二抗（1∶2 000）及 HRP標(biāo)記的抗生物素抗體（1∶1 000）室溫下孵育1 h。顯影、定影、洗片。結(jié)果用凝膠成像軟件定量掃描條帶灰度，以目標(biāo)蛋白條帶／β-actin蛋白條帶值為磷酸化水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，兩組間差異比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動物模型檢驗

對照組動脈各層結(jié)構(gòu)完整，無鈣化及脂肪沉淀。各造模組大鼠主動脈切片可見內(nèi)膜細(xì)胞增生及內(nèi)皮下出現(xiàn)淡染的空泡等動脈粥樣硬化的早期病變，有些部位可見中膜平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂或隆起呈斑塊狀結(jié)構(gòu)，有些部位中膜有明顯的鈣化形成，說明造模成功（圖1）。

Fig.1 Transmission electron micrographs（3，500×）comparing control（A）and atherosclerotic（B）vessels

2.2 血清 IL-6、TNF-α、CRP分析

實驗動物在動脈粥樣硬化造模后的血管炎性因子濃度明顯上升。AS模型組的IL-6水平相對對照組有升高，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，ASH組血清IL-6水平明顯升高，相對與AS組和對照組均有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；ASH和ASL組的血清TNF-α濃度均顯著低于AS組，但是ASL組的TNF-α濃度依然顯著高于C組；AS造模后血清的CRP水平明顯升高，運動組（包括ASL和ASH）雖然稍有降低但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，造模后各組的CRP濃度均顯著高于C組（表1）。

Tab.1 Change ofplasma IL-6 and TNF-αand CRP concentrations（±s，n＝12）

Tab.1 Change ofplasma IL-6 and TNF-αand CRP concentrations（±s，n＝12）

TNF-α：Tumor necrosis factor-α；CRP：C-reaction protein；AS：Atheroscleroticmodelgroup；ASL：Low intensity exercisemodel group；ASH：High intensity exercisemodel group*P＜0.05 vs control；＃P＜0.05 vs ASgroup

Group IL-6（pg／ml） TNF-α（ng／ml） CRP（μg／ml ）Control 98.54±23.85 0.78±0.14 1.86±0.35 AS 106.74±30.85 1.39±0.26* 3.92±0.79*ASL 112.36±27.96 1.14±0.23*＃ 3.25±0.76*ASH 136.57±32.74*＃1.09±0.27＃ 3.46±0.89*

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞AMPK蛋白表達(dá)分析

表2的實驗結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化模型組的AMPK蛋白量降低，但是與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。運動可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK蛋白表達(dá)，ASL和ASH組與對照組或模型組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。動脈粥樣硬化模型組的AMPK磷酸化低于對照組，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，運動誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK磷酸化，ASL和ASH組的p-AMPK蛋白量均顯著高于對照組或模型組，均有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

血清炎性因子在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。1995年，Ross提出AS是以炎癥反映為主要特征的一種疾病［5］，主要表現(xiàn)為動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在受到損傷后的一種炎性纖維組織增生。C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是機(jī)體在炎癥、感染和組織損傷后產(chǎn)生的一種急性期反應(yīng)蛋白，是機(jī)體非特異性炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物之一。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，AS模型組的血清CRP濃度明顯高于對照組（3.92±0.79vs1.86±0.35），這與大多數(shù)的研究結(jié)果是一致的。運動雖然有降低血清CRP的趨勢，但是與模型組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。白介素-6（IL-6）是機(jī)體一種主要的抗炎癥因子，大量文獻(xiàn)報道運動誘導(dǎo)機(jī)體血清的IL-6濃度顯著升高。本研究中大強(qiáng)度運動組的血清IL-6明顯升高，這與其他人的研究結(jié)果基本一致，但是小強(qiáng)度運動組的IL-6水平在運動后沒有顯著意義的增加，這可能是由于長期運動鍛煉導(dǎo)致的適應(yīng)性變化或運動強(qiáng)度較低所致。腫瘤壞死因子（TNF-α）可能通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)凝血、抑制纖溶、促進(jìn)單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附等作用，參與AS及冠心病的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究中，AS組的TNF-α水平明顯高于對照組，運動有效降低血清的 TNF-α水平，與AS組相比有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

Tab.2 Changes of total AMPK and p-AMPK Thr172 in vascular endothelial cell（±s，n＝4）

Tab.2 Changes of total AMPK and p-AMPK Thr172 in vascular endothelial cell（±s，n＝4）

AMPK：AMP activated protein kinase；AS：Atherosclerotic model group；ASL：Low intensity exercise model group；ASH：High intensity exercisemodel group*P＜0.05 vs control；＃P＜0.05 vs ASgroup

Group P-AMPK Thr172 Total AMPK Control 1.00±0.32 3.21±0.98 AS 0.87±0.21 2.71±0.68 ASL 1.32±0.68＃ 5.46±1.65*＃ASH 1.56±0.41*＃ 4.68±1.54*＃

Fig.2 Comparison between the relative protein content（%）of AMPK and its phosphorylated in vascular endothelial cells C：Control group；AS：Atherosclerotic model group；ASL：Low intensity exercisemodel group；ASH：High intensity exercisemodel group

AMPK是一種多功能的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，由α、β和γ3個亞單位組成。研究顯示，AMPK失活引起血脂代謝障礙、主動脈損傷是糖尿病和動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)理［6］。Goirand F等［7］利用AICAR激活血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK蛋白，引起血管舒張，表明AMPK確實具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的生理學(xué)作用。國外有研究表明［8，9］，運動能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞AMP激活蛋白激酶（5-AMP-activated protein kinase，AMPK）的磷酸化激活。血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK激活能產(chǎn)生多種有益效應(yīng)，其主要作用機(jī)制包括［3］：（1）促進(jìn)內(nèi)皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的 S1177磷酸化，上調(diào) NO釋放量，改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；（2）對抗O2-、H2O2及 ONOO-等活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）的致細(xì)胞損傷作用，保護(hù)血管內(nèi)皮；（3）通過磷酸化作用抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，降低丙二酰輔酶A的合成，促進(jìn)自由脂肪酸氧化，消減細(xì)胞脂毒性；（4）抑制核因子-κB（nuclear factorkappaB，NF-κB）活性，下調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1和細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AS模型組的AMPK蛋白量及其磷酸化均較對照組低，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而運動（包括大強(qiáng)度和小強(qiáng)度運動）顯著的上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK蛋白表達(dá)，相對對照組及AS組均有統(tǒng)計學(xué)差異。低強(qiáng)度運動誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的p-AMPK上調(diào)，相對AS組有顯著升高，但是相對對照組沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而大強(qiáng)度運動組則相對AS組和對照組均顯著上升。本研究的結(jié)果顯示，運動可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK蛋白表達(dá)及其磷酸化，可能是運動改善心血管健康，防治動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要機(jī)制。

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