張競丹，楊丹鳳，曹燕卿，李 曦，安玉林，劉嘉瀛，汪 海

（1.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長沙410078；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津300050）

高原肺水腫（high altitude pulmonary edema，HAPE）是高原病中最具有代表性的一型，比較常見且發(fā)病急驟，病死率較高。關(guān)于誘發(fā)高原肺水腫的機(jī)制尚不完全清楚，較為肯定的有血液動力學(xué)改變、體液潴留和循環(huán)障礙等［1］。一般認(rèn)為機(jī)體缺氧引起肺小動脈收縮而產(chǎn)生的肺動脈高壓和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是高原肺水腫發(fā)生的基本原因［2］。而寒冷對高原肺水腫發(fā)生的影響的研究甚少。本文采用2×2析因設(shè)計(jì)［3］，通過觀察低溫和低氧對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）在細(xì)胞膜通透性和血管活性物質(zhì)變化方面的影響，以及二者之間的協(xié)同作用，以探討低溫和低氧兩個因素在高原肺水腫發(fā)生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、I型膠原酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國 Hyclone公司）；內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑 ECGS（Upstate公司）；肝素（Amresco公司）；中性蛋白酶、DMSO、MTT、明膠（美國SIGMA公司）；內(nèi)皮細(xì)胞鑒定試劑盒（武漢原生代生物醫(yī)藥科技有限公司）；TRIZOL、PCR引物（美國 Invitrogen公司）；PCR相關(guān)試劑（天根生化科技有限公司）；LDH、SOD、MDA、NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

主要儀器設(shè)備：三氣培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司），顯微攝像系統(tǒng)（成都儀器廠），電子天平、酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan公司），PCR儀（美國 Biorad公司）。

1.2 PMVECs的培養(yǎng)、傳代及鑒定

參照相關(guān)文獻(xiàn)［4］，選用體重 100～130 g的健康雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼法處死后，迅速打開胸腔，左心耳剪一小口，從右心室注入 15～25 ml DMEM培養(yǎng)基，至肺臟發(fā)白，然后將肺取出，0.25%胰蛋白酶37℃消化5min后，pH為7.0的PBS溶液沖洗2遍，剪取2～3mm的邊緣肺組織并剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，加入2 ml I型膠原酶（2.5 mg／ml）37℃消化 15 min。然后用滴管吸出膠原酶，加入 2 ml中性蛋白酶（10 mg／ml）37℃消化 15 min。待組織塊消化完全后加入5 ml培養(yǎng)基終止消化，2 000 r／min離心 10 min，棄上清。用 3 ml胎牛血清重懸沉淀并吹打使內(nèi)皮細(xì)胞聚集，1 000 r／min離心5min，取沉淀細(xì)胞加入含有20%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3 d后換液，以后隔天換液，待細(xì)胞生長至單層即可傳代。

棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，pH為7.0的 PBS溶液洗2遍，加入0.25%胰酶1 ml，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間隙逐漸增大，細(xì)胞變圓鈍后立即加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中止消化，用吸管將細(xì)胞輕輕吹落并充分混勻，細(xì)胞懸液移入離心管中，1 000 r／min離心10min。棄上清，以1∶2分裝接種進(jìn)行傳代。

采用FITC標(biāo)記的CD31綠色熒光及植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

選取2～7代生長良好的PMVECs用于實(shí)驗(yàn)，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞同步化2 h，根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按低溫和低氧兩因素的有無，分為四組：正常對照組（37℃、21%O2）、低溫組（28℃、21%O2）、低氧組（37℃、3%O2）、低溫低氧組（28℃、3%O2）。所有實(shí)驗(yàn)組分別在不同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 培養(yǎng)液中LDH活力的測定

取2～7代生長良好的PMVECs以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。不同條件下分別培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH檢測試劑盒說明書立即檢測。

1.5 硝酸還原酶法檢測NO

取2～7代生長良好的PMVECs以2×105cells／well接種至24孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，80%融合后，換無血清培養(yǎng)基，四個條件下培養(yǎng)24 h。收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用NO試劑盒（硝酸還原酶法）檢測 NO2-／NO3-的水平。

1.6 RT-PCR法檢測VEGF、ET-1mRNA表達(dá)水平

取2～7代生長良好的PMVECs以1×106cells／ml接種至六孔板中，每組六孔。每2個孔提取一個mRNA樣本?？俁NA的提取嚴(yán)格按Trizol試劑說明書操作，紫外分光光度計(jì)測定其純度并定量。采用降落 PCR法：（1）94℃ 5min；（2）94℃ 30 s，61℃ 40 s，每次下降0.2℃直至55℃，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)；（3）72℃ 10min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖（TAE緩沖液）凝膠中進(jìn)行電泳。用凝膠成像系統(tǒng)檢驗(yàn)各條帶的積分吸光度值，以VEGF、ET-1與β-actin灰度的比值作為RT-PCR的半定量結(jié)果。引物設(shè)計(jì)如下：VEGF上游引物 5’-CAGGGAAGACAATGGGATGA-3’，下游引物 5’-AGGAAGTGGGGTAGGGAGAG-3’，擴(kuò)增基因片段長度為 470 bp；ET-1上游引物5’-CTGCCACCTGGACATCATCT-3’，下 游 引 物 5’-GCTCGGAGTTCTTTGTCTGC-3’，擴(kuò)增基因片段長度為198 bp；β-actin上游引物 5’-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3’，下游引物5’-AAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴(kuò)增基因片段長度為430 bp。以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析和處理，對測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PMVECs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液時可見內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊聚集貼壁（圖1-A），3 d后內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊已經(jīng)擴(kuò)增成內(nèi)皮細(xì)胞島（圖1-B）。生長至5～7 d時細(xì)胞可基本融合成片，鋪滿培養(yǎng)皿底。細(xì)胞在倒置顯微鏡下，呈典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，以多角形和短梭形為主，鋪路石樣鑲嵌狀排列生長（圖1-C）。第3代細(xì)胞進(jìn)行FITC標(biāo)記的CD31免疫熒光鑒定（圖1-D），綠色熒光即為內(nèi)皮細(xì)胞，顯示純度幾乎為100%；植物凝集素（BSI）結(jié)合實(shí)驗(yàn)（圖1-E），呈明亮的綠色熒光，表示所培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)為PMVECs（圖1見彩圖頁Ⅰ）。

Fig. 1 Rat pulmonary microvascular endothelial cell cultures

2.2 不同因素對PMVECs的LDH活性的影響

低溫組、低溫低氧組（Complex）的LDH活性與對照組相比均上升，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異（P＜0.01）；與低溫組、低氧組相比，低溫低氧組的 LDH活性升高的更明顯，且具有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。析因方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧對PMVECs細(xì)胞的 LDH活性都有影響（P＜0.01），而且兩者之間存在協(xié)同作用（P＜0.01，表1）。

2.3 不同因素對PMVECs的NO釋放量的影響

低溫組、低氧組、低溫低氧組的NO釋放量與對照組相比均有所下降，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異（P＜0.01）。析因方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧對PMVECs細(xì)胞的NO的釋放量都有影響（P＜0.01），而且兩因素之間存在協(xié)同作用（P＜0.05，表1）。

Tab.1 LDH leakage and releasing of NO2-／NO3-from PMVECs under the four conditions（±s，n＝3）

Tab.1 LDH leakage and releasing of NO2-／NO3-from PMVECs under the four conditions（±s，n＝3）

LDH：Lactate dehydrogenase；PMVEC：Pulmonary microvascular endothelial cell**P＜0.01 vs control group； ＃＃P＜0.01 vs hypothermia group；△△P＜0.01 vs hypoxia group

Group LDH viability（U／ml） Releasing of NO2-／NO3-（μmol／L ）Control 12.49±2.24 1.237±0.035 Hypothermia 26.42±0.78** 0.653±0.020**Hypoxia 14.10±2.87 0.654±0.040**Complex 48.37±4.42**＃?！鳌?0.292±0.040**＃＃△△

2.4 不同因素對 PMVECs的 VEGF、ET-1 mRNA表達(dá)的影響

2.4.1 不同因素對PMVECs的VEGFmRNA表達(dá)的影響 可見低溫組、低氧組、低溫低氧組的VEGF mRNA表達(dá)與對照組相比上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。低溫組與低溫低氧組之間亦有著差異，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4.2 不同因素對 PMVECs的 ET-1 mRNA表達(dá)的影響 可見低溫組、低氧組、低溫低氧組的 ET-1 mRNA表達(dá)與對照組相比上調(diào)，低溫低氧組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而低溫組和低氧組與對照組之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。方差分析結(jié)果顯示，低溫和低氧都會使PMVECs細(xì)胞的ET-1mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），而且低溫和低氧之間具有協(xié)同作用（P＜0.01，圖 3）。

Fig.2 Effectsof hypothermia，hypoxia and hypothermia combined with hypoxia on expression of VEGFmRNA in PMVECs（±s，n＝3）

Fig.3 Effectsof hypothermia，hypoxia and hypothermia combined with hypoxia on expression of ET-1 mRNA in PMVECs（±s，n＝3）

3 討論

隨著西部大開發(fā)和旅游業(yè)的發(fā)展，進(jìn)入高原地區(qū)人員也越來越多，而高原地區(qū)的低溫低氧的惡劣環(huán)境對人體的健康構(gòu)成了很大的威脅，因此各種高原病也越來越受到重視。在高原病中高原肺水腫是比較具有代表性的一型，高原肺水腫是從低海拔地區(qū)快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后發(fā)生的一種非心源性肺水腫，如不及時救治，很有可能危及生命［5］。多年來科研人員對高原肺水腫的發(fā)病機(jī)制做了大量的研究，取得了長足進(jìn)展和很多成果，但仍有一些不明之處。目前認(rèn)為血管通透性增加是高原肺水腫發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大量水分進(jìn)入肺泡而來不及重吸收導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生。以往研究的重點(diǎn)偏向于低氧對高原肺水腫發(fā)生的影響，但在環(huán)境如此復(fù)雜的高原，低溫低氧復(fù)合因素的存在是不可忽視的。當(dāng)機(jī)體急進(jìn)高原環(huán)境的時候，首先呼吸加深加快，肺通氣、潮氣量和每分通氣量瞬時增加，可較安靜時增大上千倍，將有大量低溫低氧氣體進(jìn)入呼吸道。由此，我們推想在急進(jìn)高原時發(fā)生的高原肺水腫是否由于呼氣量的增加，導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞瞬間感受大量低溫低氧氣體的傷害性刺激，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷及其功能改變，進(jìn)而誘發(fā)了高原肺水腫？因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究低溫低氧對PMVEC的損傷作用并分析其交互作用，以進(jìn)一步探討兩因素在高原肺水腫發(fā)生中的作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)壁覆蓋的一層上皮細(xì)胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機(jī)械屏障，對維持血管內(nèi)壁完整性、調(diào)節(jié)血管通透性、防止凝血和血栓形成等有重要作用。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)NO、ET-1、VEGF在維持血管張力和內(nèi)皮細(xì)胞功能方面有重要作用。以往，研究人員傾向于選擇大血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬進(jìn)行心腦血管與其他器官血管疾病機(jī)制的研究，但隨著近年來各個器官微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的成功建立，選擇疾病發(fā)生所在部位的微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠更好的模擬發(fā)病過程。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于維持正常肺功能至關(guān)重要，在病理?xiàng)l件下，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要靶細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVEC）來進(jìn)行低溫、低氧以及低溫低氧復(fù)合因素對其影響的研究，以探討高原肺水腫發(fā)生過程中低溫和低氧所起的作用。

首先，我們以乳酸脫氫酶（LDH）作為判斷細(xì)胞損傷的指標(biāo)，LDH是一種廣泛存在于細(xì)胞漿中的糖酵解酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時，LDH從細(xì)胞中釋放到細(xì)胞外的量會增加，因此測定培養(yǎng)液中的LDH含量可客觀的衡量細(xì)胞的受損程度［6］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫、低氧以及低溫低氧復(fù)合因素都會使細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性升高，且與低溫、低氧組相比，低溫低氧復(fù)合應(yīng)激組的LDH活性升高的更明顯。而析因方差分析結(jié)果顯示低溫和低氧在對細(xì)胞釋放LDH的影響上有協(xié)同作用。說明低溫和低氧在對細(xì)胞損傷作用上均有影響，而低溫低氧復(fù)合在一起造成的影響更嚴(yán)重。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能是通過其分泌的一系列血管活性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，如一氧化氮（NO）和內(nèi)皮素（ET）參與調(diào)節(jié)血管張力。NO是在血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的作用下合成，有內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的血管舒張作用［7］。ET是具有強(qiáng)大收縮作用的血管活性肽，分為三個亞型：ET-1、ET-2和ET-3，其中ET-1尤為重要，是目前已知的收縮血管作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。在生理狀態(tài)下，內(nèi)源性激動劑刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO和ET-1相互作用，處于動態(tài)平衡而共同維持正常的血管張力，一旦這種平衡被打破，內(nèi)皮細(xì)胞功能就會出現(xiàn)障礙，表現(xiàn)為NO的減少或活性降低，而ET-1的釋放增加。這與本研究的結(jié)果相符，在低溫、低氧、低溫低氧復(fù)合條件下，PMVEC細(xì)胞釋放的NO大幅度減少而ET-1的mRNA表達(dá)則增加，并且低溫和低氧存在協(xié)同作用，低溫低氧復(fù)合因素作用于PMVEC細(xì)胞比單一因素作用更強(qiáng)。說明在低溫低氧條件的作用下，PMVEC細(xì)胞的功能受損，可能導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)失常，血管收縮作用增強(qiáng)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和增加血管通透性方面起著關(guān)鍵作用［8］。有研究表明，在低氧條件下VEGFmRNA的表達(dá)上調(diào)［9］，VEGF再通過其他的多種途徑改變血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的重新分布，導(dǎo)致毛細(xì)血管的通透性增加，可能是高原肺水腫發(fā)生的重要因素之一。另外有研究結(jié)果顯示，急性缺氧大鼠肺組織中的VEGF水平明顯的升高［10］。但關(guān)于低溫對體外細(xì)胞或組織中VEGF表達(dá)的影響尚無報道。本研究的結(jié)果顯示，在低溫、低氧和低溫低氧復(fù)合條件下，PMVEC細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)均上調(diào)，并且低溫和低氧存在協(xié)同作用。VEGF的異常升高使得血管的通透性增加，大量血漿蛋白漏出，機(jī)體超負(fù)荷就會誘發(fā)肺水腫的發(fā)生。

綜上所述，本研究顯示，低溫和低氧兩個環(huán)境因素對PMVEC細(xì)胞均會產(chǎn)生損害作用，無論是在內(nèi)皮細(xì)胞功能還是細(xì)胞通透性方面，并且兩因素的共同作用下比單一因素對PMVEC細(xì)胞的損害作用更大，即低溫和低氧在對PMVEC細(xì)胞損傷作用上存在協(xié)同作用。PMVEC細(xì)胞功能受損是高原肺水腫發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。因此，我們有理由相信進(jìn)入高原地區(qū)時的低溫低氧復(fù)合的環(huán)境因素是造成高原肺水腫發(fā)生的重要原因，在防治方面除了及時吸氧外還要注意防寒保暖措施的有利實(shí)施。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ 趙貴鋒，葛德元.高原肺水腫研究進(jìn)展［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2008，29（5）：757-760.

［2］ 楊生岳，郭振援，馮恩志，等.血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子水平與高原肺水腫患者肺動脈壓的關(guān)系［J］.臨床肺科雜志，2011，16（9）：1325-1327.

［3］ 胡良平.統(tǒng)計(jì)學(xué)三型理論在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2006：94.

［4］ 梁志欣，徐淑鳳，王 平，等.大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究［J］.國際呼吸雜志，2011，31（18）：1376-1380.

［5］ Densmore JC，Signorino PR，Ou JS，etal.Endotheliumderived microparticles induce endothelial dysfunction and acute lung injury［J］.Shock，2006，26（5）：464-471.

［6］ Danz E D，Skramsted J，Henry N，etal.Resveratrol prevents doxorubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1 pathway［J］.FreeRadicalBiolMed，2009，46（12）：1589-1597.

［7］ Mam V，Tanbe A F，Vitali SH，etal.Impaired vasoconstriction and nitric oxide-mediated relaxation in pulmonary arteries of hypoxia-and monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats［J］.JPhamacolExpTher，2010，332（2）：455-462.

［8］ Hanaoka M，Droma Y，Naramoto A，etal.Vascular endothelial growth factor in patientswith high-altitude pulmonary edema［J］.JApplPhysiol，2003，94（5）：1836-1840.

［9］ Jin H L，Liu M L，Kim H A，etal.Role of the oxygen-dependent degradation domain in a hypoxia-inducible gene expression system in vascular endothelial growth factor gene therapy［J］.Spine，2009，34（26）：E952-958.

［10］ Christou H，Yoshida A，Arthur V，etal.Increased vascular endothelial factor production in the lungs of ratswith hypoxiainduced pulmonary hypertension［J］.AmJRespirCellMol Biol，1998，18（6）：768-770.