黃柏勝，彭志宏，韓 仰，舒坤賢，劉發(fā)益，鄔力祥*

(1．中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，湖南 長沙410078;2．重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)研究所，重慶400065)

甲基轉(zhuǎn)移酶樣基因9(methyltransferase like9，Mettl9)定位于大鼠染色體1q36，該基因是一種類甲基化轉(zhuǎn)移酶，屬于DREVl轉(zhuǎn)甲基酶基因家族，與DREVl基因的相似性很高［1］，它是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的p53下游基因，在人和小鼠的同源基因?yàn)镸ETTL9/PAP1基因，有關(guān)該基因的研究報(bào)道也非常少。研究發(fā)現(xiàn)，METTL9/PAP1基因在肺癌、小鼠胎肺的發(fā)育過程中特異性表達(dá)，且其表達(dá)信號的強(qiáng)弱與凋亡細(xì)胞的強(qiáng)弱成正相關(guān)［2－5］，其在胚胎發(fā)育過程中的作用很可能是通過參與細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的［3］;在胃癌和結(jié)腸癌的癌組織，METTL9基因表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡［6-7］。為進(jìn)一步揭示Mettl9基因的功能，我們克隆了大鼠Mettl9基因，構(gòu)建了含該基因的慢病毒載體，并在293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，為研究該基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，Trizol(Invitrogen公司)，PCR TaqMix(廣州東盛生物公司)，瓊脂糖(Spanish公司)，E．Z．N．A．Gel Extraction Kit(OMEGA公司)，pGEM-T Vector System(Promega公司)，大腸桿菌DH5α菌株為本室保存，慢病毒載體pLenti6．3-MCSIRES-EGFP(Invitrogen公司)，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa公司)，酵母浸出粉、精解蛋白胨(Oxoid公司)，小量質(zhì)粒快速提取試劑盒(北京博大泰克公司)，PacI、AscI、BamHI、XhoI和T4連接酶以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)。

1．2 方法

1．2．1 目的基因的體外擴(kuò)增與克隆 從原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中，按照Trizol說明書提取該細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中的Mettl9基因序列(NM_001163164)，設(shè)計(jì)一對RT-PCR引物，覆蓋完整的閱讀框，引物序列如下:上游5'-CCTCGAGATAGACTGTTGGCGGGCTGGCTGTGCC-3'，下游5'-GGATCCCGTTACACTGGTCTGAGAACAAAG ACAGC-3'，分別在上、下游引物加XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，引物由上海博尚生物技術(shù)公司合成。通過T-A克隆，將DNA凝膠回收純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM?-T Vector通過T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9。

1．2．2 陽性克隆的酶切鑒定與測序 采用XhoI和BamHI雙酶切鑒定上述重組質(zhì)粒，取雙酶切初步認(rèn)定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定(由上海博尚生物技術(shù)公司完成)。

1．2．3 含Mettl9基因的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成亞克隆PCR引物，上游、下游引物5'端分別加入PacI、AscI酶切位點(diǎn)序列(下劃線部分)，引物序列如下:上游5'-ATCATGTTAATTAAGCCACCATGAGACTGTTGGCGGGCTG-3'，下游5'-ATTATTGGCGCGCCTTACACTGGTCTGAGAACAA AGACAGC-3';用以上引物從質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9中擴(kuò)增目的基因片段，將PCR產(chǎn)物電泳用DNA凝膠回收試劑盒回收，再用PacI和AscI對目的基因片段和pLenti6．3-MCS-IRES-EGFP空載體同時(shí)進(jìn)行酶切2 h，將酶切產(chǎn)物電泳并回收酶切后的目的基因片段和pLenti6．3-MCS-IRES-EGFP，T4連接酶連接回收的目的基因片段和載體，室溫連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，搖菌，提取小量質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定。

1．2．4 慢病毒表達(dá)載體的病毒上清包裝 取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，采用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染所構(gòu)建的慢病毒載體至293T細(xì)胞，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS。轉(zhuǎn)染換液24 h后，收集培養(yǎng)上清，為慢病毒液第一次收集，再加入10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染換液48 h后，再次收集培養(yǎng)上清，為慢病毒液第二次收集。將兩次收集到的病毒原液混合均勻后，4℃，3 000 r/min離心30 min，去除細(xì)胞和碎片，上清用0．45μm的濾器過濾。最后進(jìn)行慢病毒液的濃縮和分裝，將慢病毒原液50，000 g，4℃超速離心2 h，去除上清，沉淀溶解在含有2%FBS的DMEM中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體要求進(jìn)行分裝，并留樣進(jìn)行滴度測定。

1．2．5 慢病毒活性滴度測定 慢病毒滴度測定前一天細(xì)胞鋪板，293T細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪96孔板，約8 000個(gè)細(xì)胞每孔。72 h后，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為各孔中表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)平均數(shù)除以每孔中含有的慢病毒液體積。

1．2．6 包裝后的慢病毒表達(dá)載體在U251細(xì)胞的表達(dá) 用包裝后含有目的基因的慢病毒表達(dá)載體感染培養(yǎng)的U251細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2．1 大鼠Mettl9基因的克隆

2．1．1Mettl9基因的RT-PCR擴(kuò)增 提取大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為954 bp的片段，與目的基因片段大小一致(圖1)。

2．1．2 重組質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9的雙酶切鑒定結(jié)果 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收純化后與pGEM?-T Vector連接，經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切鑒定，得到兩條分別約3 000 bp的pGEM?-T空載體和954 bp的插入片段(圖2)。

2．1．3 重組質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9的序列測定取酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，由上海博尚生物技術(shù)公司測序，測得序列全長為954 bp(圖3)，將序列向GenBank遞交獲收錄號HQ898855。

2．2 慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的構(gòu)建

2．2．1 慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的雙酶切鑒定 取陽性克隆的質(zhì)粒，用PacI和AscI雙酶切鑒定，得到約9 387 bp的慢病毒載體片段和954 bp的插入片段(圖4)。

圖1 大鼠Mettl9基因的PCR擴(kuò)增Fig．1 PCR amplification of rat Mettl9 gene

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig．2 Enzyme digestion of the recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9的序列測定圖Fig．3 The sequencing map of pGEM?-T-Mettl9

圖4 慢病毒表達(dá)載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的雙酶切鑒定Fig．4 Double-enzyme digestion of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP

2．2．2 慢病毒載體的包裝結(jié)果 慢病毒載體在293T細(xì)胞包裝24 h后，由于表達(dá)載體帶有GFP報(bào)告基因，在熒光顯微鏡下可以看到外源基因大量表達(dá)后所發(fā)生的綠色熒光(圖5)。

圖5 慢病毒載體在293T細(xì)胞包裝24 h后的熒光和可見光結(jié)果Fig．5 The image of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP packaged in 293T cells for 24 h under microscopy

2．2．3 慢病毒載體活性滴度測定結(jié)果 慢病毒對293T細(xì)胞系具有感染能力，并且與不同的稀釋倍數(shù)相關(guān)，慢病毒對細(xì)胞的感染力直接反映在帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量上(圖6)。從圖6可以明確地看到，病毒液稀釋的倍數(shù)越高，感染的細(xì)胞越少。對GFP計(jì)數(shù)后可知，本實(shí)驗(yàn)中該慢病毒載體的生產(chǎn)體系所獲得的病毒滴度約為1．825×108TU/mL。

圖6 包裝后的慢病毒載體滴度測定(100×)Fig．6 Measurement of viral titer(100×)

2．2．4 包裝后的慢病毒載體感染體外培養(yǎng)的U251細(xì)胞 用慢病毒載體感染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光(圖7)，說明所構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體在293T細(xì)胞包裝后能將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。

圖7 包裝后的慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRESEGFP在U251細(xì)胞的表達(dá)Fig．7 The expression of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGF in U251 cells

3 討論

p53基因生物學(xué)效應(yīng)主要是通過激活或抑制大量下游基因表達(dá)來完成的，p53及其下游基因所組成的p53基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)才是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的根本，而p53基因處于這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。P53蛋白主要功能包括誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、DNA的修復(fù)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而避免受損DNA的堆積、維持基因組的穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老、抑制腫瘤血管增生等。大量研究證明p53下游基因主要包括:p21、CD95/fas、p53AIP1、pag608、gadd45、mdm2、bax、pig3、Cyclin G等［8］，正是這些受p53基因調(diào)控的下游基因直接實(shí)現(xiàn)p53基因的眾多生物學(xué)功能。Mettl9基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的p53下游基因，與小鼠、人的序列同源性分別為98%、93%，該基因的激活可能主要是通過P53蛋白與其特異性序列結(jié)合，從而促使或抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯;該基因與野生的p53結(jié)合，DNA上的多個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生高度甲基化，導(dǎo)致腫瘤抑制因子等重要基因失活。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌、結(jié)腸癌組織中METTL9基因的表達(dá)與p53基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［6，7］。在小鼠胚胎發(fā)育的不同時(shí)期Mettl9基因表達(dá)信號的強(qiáng)弱與凋亡信號幾乎成正相關(guān)。在腦損傷中，p53基因的表達(dá)上調(diào)，抑制p53基因的表達(dá)則對腦缺血性損傷組織具有一定的保護(hù)作用。在大鼠腦缺血再灌注損傷過程中誘導(dǎo)的p53基因表達(dá)的上調(diào)與細(xì)胞凋亡信號的強(qiáng)度一致。在腦缺血后海馬CA1區(qū)p53的表達(dá)增多。由制滴菌素A誘導(dǎo)的C6細(xì)胞凋亡中，p53的表達(dá)特異性的增高［9］。在大鼠視網(wǎng)膜缺血性再灌注損傷中，p53基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系，可能起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

從UniGene數(shù)據(jù)庫中檢索可知Mettl9、METTL9與PAP1屬于不同物種的同源基因。我們克隆了大鼠Mettl9基因，并向GenBank遞交獲得收錄號HQ898855。在本研究中我們提取了原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增出Mettl9基因。首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM?-T-Mettl9，便于大量擴(kuò)增獲取目的基因，在構(gòu)建慢病毒載體時(shí)采取直接擴(kuò)增上述重組質(zhì)粒的目的基因，連接到慢病毒載體上進(jìn)行包裝。慢病毒載體基于HIV改造產(chǎn)生的，相對于以往使用的腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，具有容納外源性目的基因片段大，在體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，免疫反應(yīng)小以及安全性較好等優(yōu)點(diǎn)［10-13］，目前，慢病毒載體經(jīng)過不斷改造優(yōu)化，在生物安全性、病毒滴度及靶細(xì)胞嗜性范圍方面均有提高，不會引起導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡的免疫反應(yīng)，并能夠提供高效的基因轉(zhuǎn)移和長期穩(wěn)定的蛋白表達(dá)。包裝細(xì)胞系的建立是獲得完整病毒顆粒并得以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，所獲病毒滴度的高低對基因治療成功與否尤其重要。本研究中選用來源于人胚腎細(xì)胞系的293T包裝細(xì)胞完成對慢病毒載體的包裝，我們獲得用于轉(zhuǎn)染真核靶細(xì)胞的完整病毒顆粒，測得病毒滴度為1．825×108TU/mL。腦膠質(zhì)瘤是臨床上顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種，起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段及多基因參與的遺傳性疾病，p53抑癌基因失活在膠質(zhì)瘤向癌的轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用。本研究我們用含Mettl9基因的慢病毒載體的包裝系統(tǒng)感染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明含目的基因的慢病毒表達(dá)載體包裝成功并能感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞，慢病毒載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究Mettl9基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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