劉超，黨江波，魏燁昕，吳天姣，汪衛(wèi)星，郭啟高，梁國魯

西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）標(biāo)記是Collard和Mackill[1]于2009年發(fā)明的一種基于SPAR目的基因分子標(biāo)記, 是一種能跟蹤性狀的分子標(biāo)記技術(shù)。與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，具有易于建立體系、與性狀連鎖、重復(fù)性較好、物種間通用等特點(diǎn)，近年來得到一定程度的應(yīng)用。該分子標(biāo)記最早應(yīng)用于水稻[1]，其后，在菠蘿[2]、葡萄[3]、龍眼[4]、草莓[5]、柑橘[6]、牡丹[7]中也得到應(yīng)用。目前，已應(yīng)用于煙草遺傳分析的分子標(biāo)記有RAPD，SSR，ISSR，AFLP，SRAP等[8]，但SCoT應(yīng)用于煙草中還未見相關(guān)報(bào)道。

煙草生產(chǎn)病害嚴(yán)重，亟待優(yōu)良抗病品種[9]。在煙草種及同屬野生種中存在大量抗病資源，將具抗病性的野生種與栽培品種進(jìn)行雜交一直是煙草獲得抗病力的主要方法之一[10]。在雜交育種中，對(duì)雜種后代的早期鑒定是非常重要的環(huán)節(jié)。目前，尚未見利用SCoT標(biāo)記進(jìn)行種間雜種鑒定的報(bào)道。因此，本文利用SCoT標(biāo)記技術(shù)對(duì)煙草種間雜種進(jìn)行鑒定，為煙草分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料共23份，包括兩個(gè)野生種N. glutinosa、N. plumbaginifolia和11個(gè)煙草品種Beinhart1000-1（雪茄），K326（烤煙），L-8（白肋），Coker176（烤煙），F(xiàn)lorida301（雪茄），TI448A（白肋），遵煙6號(hào)（烤煙），長征1號(hào)（烤煙），云煙85（烤煙），云煙97（烤煙），云煙87（烤煙），見表1。N. plumbaginifolia作父本與云煙87雜交后代10株，分別編號(hào)為YP1、YP2…YP10。均種植于西南大學(xué)果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基地。

表1 供試材料

36個(gè)SCoT引物序列SP1、SP2……SP36均參照Collard和Mackill[1]，由上海生工生物工程有限公司合成。DL2000 marker，dNTPs，Taq DNA聚合酶，10×Buffer等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及PCR反應(yīng)

DNA提取采用改良CTAB法[11]。

PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照韓國輝等[12]的報(bào)道反應(yīng)體系為20μL： 10×buffer 2.0μL，Mg2+1.875mmol/L，dNTP 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5Μ，的DNA模版50 ng，引物0.75μmol/L。反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)36次，72℃延伸10min。

電泳及拍照：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用銀染檢測(cè)。

1.2.2 條帶記錄與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

SCoT分子標(biāo)記技術(shù)是多位點(diǎn)顯性標(biāo)記技術(shù)，對(duì)擴(kuò)增清晰且易于辨認(rèn)的條帶采用0-1系統(tǒng)記錄其位置，在相同遷移位置有帶的記為“1”，無帶記為“0”，建立SCoT標(biāo)記的0、1矩陣。利用NTSYS-2.0軟件，把得到的0-1矩陣輸入到NTSYS-2.0計(jì)算遺傳相似系數(shù)并按ΜPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT分子標(biāo)記在煙草中的適用性

以“云煙97”為模板，分別用36個(gè)SCoT引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1,各引物所擴(kuò)增出的條帶數(shù)介于3-15，大部分引物擴(kuò)增出的條帶較多，也較清晰（圖1）。 可見該體系適于SCoT引物對(duì)煙草基因組DNA的擴(kuò)增。

圖1 36條引物擴(kuò)增云煙97總DNA所得產(chǎn)物的電泳圖譜

2.2 不同煙草材料的SCoT分子標(biāo)記多態(tài)性

2.2.1 11個(gè)煙草品種的SCoT分子標(biāo)記多態(tài)性

篩選9條多態(tài)性較好的引物對(duì)11個(gè)煙草品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物Sp15在Beinhart1000-1、L-8、Florida 301、TI448A、CZ-1中均擴(kuò)增出長度約750 bp的條帶，這5個(gè)煙草品種除CZ-1為烤煙外，其余均非烤煙；SP30在K326、Coker176、云煙85、云煙87、云煙97這5個(gè)烤煙品種中擴(kuò)增出一條長度約500 bp的條帶，而其余品種未見此條帶。此外，亦有Sp21在L-8、Florida 301、TI448A、云煙85中擴(kuò)增出一條約750bp的條帶，Sp27在Beinhart1000-1、L-8、Florida 301、TI448A、CZ-1擴(kuò)增出了一條約750bp的條帶。Sp6在Florida 301、TI448A中擴(kuò)增出約750bp的條帶，在其他品種中沒有擴(kuò)增出該條帶。這與袁洪[13]得出的白肋煙和烤煙品種遺傳多樣性指數(shù)存在顯著差異相一致。祁建民等[14]認(rèn)為煙草栽培種經(jīng)自然和人工選擇，產(chǎn)生了種內(nèi)不同類型和較大的遺傳變異。

圖2 引物Sp-15（A）和引物Sp-30（B）對(duì)普通煙草的各種類型DNA擴(kuò)增出的條帶

分析SCoT引物在普通煙草的各種類型普通煙草的各種類型擴(kuò)增的條帶多樣性較差。9條引物， 共擴(kuò)增出條帶118條，其中多態(tài)性條帶僅42條，多態(tài)性比例僅35.59%。經(jīng)相似性分析表明，各煙草品種間的相似性系數(shù)均高于0.9，而傳統(tǒng)標(biāo)記如ISSR等技術(shù)分析普通煙草的各種類型相似系數(shù)介于0.6-1.0[15-16]。可見SCoT引物擴(kuò)增出的多樣性條帶比例較低，不宜用于普通煙草的遺傳關(guān)系分析，但引物Sp-15、Sp-27、Sp-30可在一定程度上區(qū)分某一類型（如烤煙）與其它類型品種。這可能與SCoT不能覆蓋全基因組有關(guān)。

2.2.2 3個(gè)煙草種間SCoT分子標(biāo)記的多態(tài)性

應(yīng)用上面的SCoT體系對(duì)N. glutinosa、N.plumbaginifolia與普通煙草Beinhart1000-1進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)。9條引物共擴(kuò)增出163條帶，其中多態(tài)性條帶135條，多態(tài)性比例為82.82%，其中SP27號(hào)引物的多態(tài)性比例最高，達(dá)到了90.91%，說明3個(gè)煙草種的多態(tài)性比較豐富。相似性分析表明，N. glutinosa與11個(gè)煙草品種的相似系數(shù)在0.5左右，與梁景霞等[16]的報(bào)道相近；N. plumbagini flia與11個(gè)煙草品種的相似系數(shù)在0.36-0.39，與李鳳霞等[17]的報(bào)道相近?？梢?，SCoT標(biāo)記適于上述3個(gè)煙草種遺傳關(guān)系的分析。

圖3 引物SP3（A）、SP13（B）、SP23（C）、SP24（D）、SP34（E）擴(kuò)增N. glutinosa（1）、N. plumbaginifolia（2）、Beinhart1000-1（3）3個(gè)材料DNA產(chǎn)物的電泳圖譜

2.3 煙草遠(yuǎn)緣雜交后代群體的SCoT鑒定

從36條SCoT引物中篩選出能在兩親本間擴(kuò)增出特異條帶的引物17條，其中17條均能在子代中擴(kuò)增出母本特異條帶，17條中有11條能在子代中擴(kuò)增出父本的特異條帶。據(jù)統(tǒng)計(jì)，子代具有的與母本相同的特異條帶有76條，與父本相同的特異條帶48條，可見10株雜交后代都為云煙87與藍(lán)茉莉葉煙草的真雜種，且這10株雜種與其母本云煙87更為相似。

圖4是引物SP6的擴(kuò)增結(jié)果，從圖中可看出，10個(gè)子代均能擴(kuò)增出2條父本特異條帶和3條母本特異條帶。

圖4 引物SP-6對(duì)親本和10株雜種后代擴(kuò)增結(jié)果注： 所示為父本特異條帶；所示為母本特異條帶。

上述能在子代中擴(kuò)增出父本的特異條帶的11條引物能在10株或部分后代中擴(kuò)增出父母本特異條帶的引物所擴(kuò)增出的特異條帶數(shù)量有一定差異，部分引物如SP8、SP13、SP27、SP30、SP34能在部分后代中擴(kuò)增出父母本所沒有的特異條帶。

表2 11條引物對(duì)10株后代擴(kuò)增情況

3 討論

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性利用的是啟動(dòng)密碼子（ATG）兩端堿基的保守性和多態(tài)性設(shè)計(jì)而成，其擴(kuò)增產(chǎn)物因啟動(dòng)子兩端堿基的變化以及堿基插入-缺失引起的變化而呈現(xiàn)不同的片段，這說明該引物可跟蹤性狀變化[18]。SCoT標(biāo)記與功能基因相關(guān)，能對(duì)部分與性狀相關(guān)的DNA序列進(jìn)行差異擴(kuò)增，因此在同一種不同品種間的多態(tài)性并不是非常豐富，但其所示差別可能與相關(guān)性狀相關(guān)[19]。但該標(biāo)記并不能覆蓋全基因組，其多態(tài)性可能不能與其它標(biāo)記相比。在本研究中，普通煙草的各種類型間的多態(tài)性較差，但是部分引物可以將部分烤煙品種與曬煙、白肋煙相區(qū)分開來，這為煙草性狀的基因定位提供了一定的參考。由于煙草部分種間性狀差異較大，如本研究所用的黏煙草和藍(lán)茉莉葉煙草，其在植株形態(tài)、花的形態(tài)等外觀形態(tài)方面均存在巨大差異，因此通過SCoT標(biāo)記可以將其區(qū)分開來。

遠(yuǎn)緣雜交是現(xiàn)代作物育種中的一個(gè)重要方面。煙草屬中眾多野生種是煙草栽培品種的優(yōu)良抗源，將野生種的抗性轉(zhuǎn)入普通煙草中是目前煙草抗病育種的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)，其中遠(yuǎn)緣雜交是一個(gè)常用的方法[10]。在遠(yuǎn)緣雜交中，對(duì)后代是否真雜種的鑒定非常重要，常規(guī)的雜種鑒定主要有形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的方法。雜種后代苗期形態(tài)差異不大，所以形態(tài)學(xué)鑒定較為費(fèi)時(shí)。細(xì)胞學(xué)的鑒定則需通過染色體核型分析等手段，由于染色體制片的繁瑣及其對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的高要求，對(duì)于部分雜種后代的鑒定也較為費(fèi)時(shí)[20]。因此，選用分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定較為理想[21]。賈志剛等[22]運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記分析了枇杷雜交后代與親本之間的多態(tài)性。韓國輝等[6]也將SCoT標(biāo)記應(yīng)用于沙田柚雜交后代的群體鑒定。本研究中成功的應(yīng)用SCoT分子標(biāo)記鑒定了10株云煙97與藍(lán)茉莉葉煙草的雜交后代的雜種真實(shí)性。

由于作物育種主要對(duì)其性狀進(jìn)行關(guān)注，因此，與性狀密切連鎖的分子標(biāo)記對(duì)加快育種進(jìn)程有重大意義。將SCoT分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草材料的遺傳分析將對(duì)煙草的分子標(biāo)記輔助育種作重要補(bǔ)充。

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