王振國，肖鵬，陳秋雙，李棟梁，王飛，尹朝先，李石力，丁偉.4

1 中國煙草總公司重慶市公司奉節(jié)分公司，重慶 奉節(jié) 404600；2 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 北碚 400716；3 奉節(jié)縣農(nóng)委植物保護(hù)與植物檢疫站，重慶 奉節(jié) 404600；4 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶 北碚 400716

煙草野火病(Pseudomonas syringaepv. tabaci) 是一種細(xì)菌性葉部病害，具有爆發(fā)性和破壞性，是影響煙葉生產(chǎn)的主要病害之一。其藥劑防治研究結(jié)果普遍都表現(xiàn)為[1-3]：室內(nèi)活性測定效果較好，大田推廣使用時，由于受到藥劑持效期、氣候條件、病原抗藥性的產(chǎn)生等因素的影響，導(dǎo)致其防治效果不夠理想。當(dāng)前，生產(chǎn)上關(guān)于野火病的防治現(xiàn)狀為：單獨(dú)使用一種或兩種傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑已經(jīng)很難有效控制野火病的發(fā)生和流行，且在野火病的防治過程中大量使用抗生素類藥劑，此類藥劑持效期長、殘留性強(qiáng)，對環(huán)境安全、煙葉及其制品的安全性具有較大的潛在危害性。

水楊酸 (Salicylic acid, SA) 是植物體內(nèi)的小分子物質(zhì)，其化學(xué)名稱為鄰羥基苯甲酸。由于水楊酸由植物自身合成，含量較低，可在韌皮部運(yùn)輸，在植物生長過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]，很多專家學(xué)者將其視為植物激素家族的一新成員[6]，并且水楊酸還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性以及抵抗不良因素造成的傷害[7-9]。近期關(guān)于水楊酸誘導(dǎo)植物抵抗病害的研究很多，如王瑞霞等用平板法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MC)方法研究了水楊酸誘導(dǎo)處理水稻后產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對稻瘟病 (Magnaporthe grisea) 孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明水楊酸處理后的水稻葉片提取物質(zhì)對稻瘟病菌孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用[10]；謝鑫等通過用不同濃度的水楊酸處理煙草以測定其對TMV抑制的最佳濃度，發(fā)現(xiàn)8 mmol/L的水楊酸對TMV的抑制效果最好，且在誘導(dǎo)處理后7 d達(dá)到最佳為61.29%[11]；杜小鳳等發(fā)現(xiàn)不同濃度的水楊酸處理對黃瓜根結(jié)線蟲都具有一定的防治效果[12]。

針對煙草生產(chǎn)上野火病危害嚴(yán)重、防治困難的現(xiàn)狀，并在前人對水楊酸研究成果的基礎(chǔ)之上，以尋求控制煙草野火病的最佳物質(zhì)為目的，研究了水楊酸誘導(dǎo)煙草對野火病的抑制作用及其對煙株主要生物學(xué)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

水楊酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；赤霉素：0.15%水劑，貴州省遵義泉通化工廠；胺鮮酯：1.6%水劑，鄭州農(nóng)達(dá)生化制品廠；農(nóng)用鏈霉素：72%可濕性粉劑，石家莊通泰生化有限公司。

1.1.2 供試品種

貴煙4號。

1.1.3 供試地塊

試驗(yàn)于2012年在重慶市奉節(jié)縣太和鄉(xiāng)石盤村選取具有代表性的地塊進(jìn)行 (海拔1310 m，北緯30°38′，東經(jīng)109°12′)。地塊相對比較平整，肥力中等、均勻，土壤粘性、有機(jī)質(zhì)及微量元素含量中等，海拔1290 m，該地塊有多年種煙歷史。5月23日移栽，株距為60 cm，行距為115 cm。6月下旬進(jìn)入團(tuán)棵期，7月下旬進(jìn)入打頂期。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理1：水楊酸，2000倍液，使用前用少量酒精溶解后再兌水混用；處理2：0.15%赤霉素水劑，1000倍液；處理3：1.6%胺鮮脂水劑，1500倍液；處理4：72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑，1200～1500倍液 (推薦劑量)；處理5：清水對照。以上處理，施藥方法均為葉面噴霧。

每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個小區(qū)45～50 m2(約70株煙)，隨機(jī)排列，設(shè)置保護(hù)行。處理1至處理3，以及處理5均于伸根期 (6月5日) 進(jìn)行第一次處理，于團(tuán)棵期 (6月28日) 和旺長期 (7月15日) 進(jìn)行第二、三次處理；處理4團(tuán)棵期 (6月28日) 進(jìn)行第一次施藥處理，旺長期 (7月15日) 進(jìn)行第二次施藥，共2次。施藥后，保證藥液均勻分布于煙葉的正反兩面、以霧滴不下滴為宜。每次施藥處理后6～8小時內(nèi)無有效降雨，否則重新施藥。試驗(yàn)過程中不噴施殺菌劑，其他農(nóng)藝措施同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)操作。

1.2.2 病情調(diào)查

每個小區(qū)采用“對角線五點(diǎn)法”選點(diǎn)，每點(diǎn)掛牌定5株，每小區(qū)固定調(diào)查25株，共調(diào)查3次。第一次藥后調(diào)查于6月26日進(jìn)行，第二、三次藥后調(diào)查分別于7月9日和7月25日進(jìn)行。病害分級標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T23222-2008《煙草病蟲害調(diào)查與分級》中的煙草野火病部分。利用公式(1)計(jì)算病葉率，利用公式 (2)計(jì)算病情指數(shù)，利用公式 (3) 計(jì)算防治效果，用SPSS軟件中的“新復(fù)極差—鄧肯”法對病情指數(shù)、誘抗(防治) 效果進(jìn)行方差分析。

1.2.3 生物學(xué)性狀調(diào)查

按 YC/T142-1998《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》對煙株的葉片數(shù)、最大腰葉長、最大腰葉寬、株高以及莖圍進(jìn)行調(diào)查，并利用公式 (4)、(5) 計(jì)算葉面積。于團(tuán)棵期(6月27日)、打頂期(7月26日)，共調(diào)查兩次。調(diào)查時，采用“對角線五點(diǎn)法”選點(diǎn)，每點(diǎn)定5株，每個小區(qū)定株調(diào)查25株。

2 結(jié)果

2.1 水楊酸對煙草野火病的控制效果

水楊酸對煙草野火病發(fā)生情況的影響明顯，主要表現(xiàn)在病葉率、病情指數(shù)、防控效果三個方面。具體結(jié)果見圖1和表1。3次調(diào)查均顯示水楊酸處理后的小區(qū)，煙草野火病的發(fā)病率最小 (見圖1)。

由表1分析可知：水楊酸及其他常規(guī)植物激素物質(zhì)在伸根期期施用對野火病的控制效果普遍較差，水楊酸和氨鮮酯具有一定效果分別為36.38%、16.75%；第2次藥劑處理后 (7月9日) 調(diào)查結(jié)果顯示，2次施用水楊酸處理后的小區(qū)對野火病的控制效果(60.63%) 明顯好于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素單獨(dú)施用一次的效果(31.10%)，且優(yōu)于于常規(guī)植物激素物質(zhì)赤霉素(22.35%)和胺鮮酯(32.48%)，但差異不顯著(P＞0.05)；第3次處理后 (7月25日) 調(diào)查結(jié)果顯示，3次使用水楊酸處理對野火病的控制效果更佳(71.90%)，明顯優(yōu)于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素施用2次的效果(30.04%)，同時也優(yōu)于常規(guī)植物激素物質(zhì)赤霉素(42.09%)和胺鮮酯(48.74%)，且水楊酸處理與其他處理的差異顯著(P＜0.05)。

圖1 水楊酸對煙草野火病病葉率的影響

表1 水楊酸對煙草野火病的控制效果

2.2 水楊酸對煙株生物學(xué)性狀的影響

水楊酸對煙株生物學(xué)效應(yīng)主要體現(xiàn)在有效葉片數(shù)、株高、莖圍以及最大葉面積四個指標(biāo)上。具體結(jié)果見圖2至圖5。

有效葉片數(shù)(圖2)團(tuán)棵期 (6月27日) 各處差異不明顯，在10.20～11.13之間，打頂期(7月26日) 處理2 (赤霉素) 對煙株的有效葉片數(shù)有明顯的抑制作用，而水楊酸及其他處理對葉片數(shù)的影響較小。處理2 (赤霉素) 對株高（圖3)有促進(jìn)作用，且這種作用在打頂期較為明顯，水楊酸及其他處理對煙草株高的影響較小。處理2 (赤霉素) 對煙株莖圍(圖4)有明顯的抑制作用，水楊酸及其他處理與空白對照差異很小。赤霉素的早期施用對煙株葉面積(圖5)的增加有明顯的抑制作用，胺鮮酯處理能促進(jìn)了煙株葉面積的增加，水楊酸與其他處理對煙草葉面積的影響較小。

總之，在葉片數(shù)、株高、莖圍以及最大葉面積上，水楊酸與空白對照相比不存在較大的促進(jìn)作用，也不存在副作用。

圖2 不同處理對煙株葉片數(shù)的影響

圖3 不同處理對對煙株株高變化的影響

圖4 不同處理對煙株莖圍變化的影響

圖5 不同處理對煙株最大葉面積的影響

3 討論

從水楊酸誘導(dǎo)煙草抵抗野火病的效果上看，水楊酸通過提前處理增加煙草自身抗病能力對煙草抵抗野火病的效果，明顯好于在發(fā)病后用農(nóng)用鏈霉素連續(xù)處理2次直接防治野火病的效果，這一結(jié)論與其他研究者就水楊酸在煙草或其他作物上關(guān)于抵抗病害的研究結(jié)論相一致：如郝中娜等[13]測定了7種非殺菌劑對煙草野火病病菌的室內(nèi)抑菌效果及其作用煙株以后的誘抗效果，結(jié)果表明：7種物質(zhì)對野火病菌均沒有直接的殺傷作用，但水楊酸和草酸作用于煙株以后對野火病具有較好的誘抗效果；王媛等[14]對擬南芥植株噴施水楊酸后，接種灰霉病菌(Botrytis cinerea)，觀察植物對病原物反應(yīng)的變化，結(jié)果表明：在平板培養(yǎng)中水楊酸對灰霉菌分生孢子的萌發(fā)及菌絲的生長均無明顯抑制作用，但對擬南芥植株用水楊酸處理后導(dǎo)致植株體內(nèi)PAL和POD活性升高、木質(zhì)素積累從而產(chǎn)生抗病性，病情明顯減少。近年來，大量的研究[15-20]證明，水楊酸在激活雙子葉植物的防御反應(yīng)中起著重要的作用。

水楊酸作用于煙草能誘導(dǎo)其抵抗野火病，且具有較好效果，這種效果的產(chǎn)生可能通過以下幾種方式實(shí)現(xiàn)：(1)改變植物抗病性酶活性。水楊酸一方面能夠增加超氧化物歧化酶(SOD)等促進(jìn)H2O2產(chǎn)生酶類的活性，另一方面能夠抑制過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等促進(jìn)H2O2降解酶的活性[21]，從而促進(jìn)植物體內(nèi)超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)的含量的增加，這些物質(zhì)可以直接殺傷病原物，參與膜脂過氧化，介入超敏反應(yīng)(HR)，同時促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化和HR細(xì)胞的死亡，使感病植物獲得抗病性。(2)誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)的合成。PR蛋白是在植物受到病原物侵染以后產(chǎn)生的一種或多種蛋白質(zhì)，它具有抗蛋白水解酶的特性，可以抵抗病原菌的侵染，是植物潛在的抗性物質(zhì)。用水楊酸處理植物可以誘導(dǎo)某些PR蛋白的產(chǎn)生，從而使植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[22-24]。如用水楊酸處理煙草可以誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生9種PR蛋白的mRNA，并在轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)PR蛋白合成[25]；Ohashi用SA處理煙草葉片7天后，PR蛋白的含量高達(dá)100 μg/gFW，是未用水楊酸處理葉片的1000多倍，在如此大量PR蛋白的組織中TMV病毒都難以存活[26]。(3)抑制病原致病性酶活性。病原侵染后能夠分泌多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、纖維素酶等用來降解寄主細(xì)胞壁的胞外酶，實(shí)現(xiàn)對寄主植物的侵染與破壞，但用水楊酸處理植物以后可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抑制這些降解酶活性的物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對植物的保護(hù)。如Palva研究[27]發(fā)現(xiàn)，水楊酸對細(xì)菌Erwinia carotovorasubsp. Carotovora分泌的植物細(xì)胞壁降解酶具有抑制作用，用1 mmol/L的水楊酸處理煙草葉片后，細(xì)菌的生長就被抑制，處理4～5天后，抑制效果最顯著。

水楊酸作為一種植物調(diào)控物質(zhì)，其在生產(chǎn)使用上具有使用劑量小、使用時間要求嚴(yán)格、使用環(huán)境要求高等特點(diǎn)，因此，在使用過程中要特別注意其準(zhǔn)確的使用濃度、適當(dāng)?shù)奶幚聿课?、正確的處理時間等，才能保證其誘導(dǎo)作物抵抗病害的效果。另外，水楊酸水溶性較小、只溶于有機(jī)溶劑，將其作為防治煙草野火病的有效物質(zhì)，在以后的應(yīng)用和研究過程中要進(jìn)一步加快以水楊酸為有效成分的新型誘導(dǎo)殺菌劑的研制與開發(fā)工作，不斷完善其用于防治煙草野火病的最佳施用時間和劑量的篩選，并針對煙草整個生育期組配關(guān)于野火病控制的系統(tǒng)控制方案。

4 結(jié)論

水楊酸作為一種新型的植物激素物質(zhì)，對煙草野火病的控制具有一定效果，且無毒副作用，符合未來綠色、安全、優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的需要，具有巨大的潛在發(fā)展空間。

[1]魏代福, 譚青濤, 張廣民. 防治煙草野火病的藥劑測定與篩選[J]. 中國煙草科學(xué), 2010, 31(2): 42-44.

[2]王振國, 丁偉. 煙草野火病發(fā)生與防治的研究進(jìn)展[J].中國煙草學(xué)報, 2012, 18(2): 101-106.

[3]劉雅婷, 張世珖, 李永忠, 等. 防治煙草野火病的藥劑篩選及應(yīng)用研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2002, 28(2): 109-111.

[4]原永兵, 曹宗巽. 水楊酸在植物體內(nèi)的作用[J]. 植物學(xué)通報, 1994, 11(3): 1-9.

[5]李德紅, 潘瑞熾. 水楊酸在植物體內(nèi)的作用[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1995, 31(2): 144-149.

[6]Raskin I. Salicylate, a new plant hormone [J]. Plant Physiology, 1992, 99(3): 799-803.

[7]Daw B D, Zhang L H, Wang Z Z. Salicylic acid enhances antifungal resistance to Magnaporthe grisea in rice plants[J].Australasian Plant Pathology, 2008, 37: 637-644.

[8]張智慧, 聶燕芳, 何磊, 等. 外源水楊酸誘導(dǎo)水稻相關(guān)防御酶活性及內(nèi)源水楊酸含量的變化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 29(5): 541-545.

[9]張衍榮, 王小菁, 張曉云, 等. 水楊酸對豇豆枯萎茵的抑制作用[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 25(6): 610-613.

[10]王霞, 王振中, 紀(jì)春燕, 等. 水楊酸誘導(dǎo)水稻抗菌物質(zhì)對稻瘟病的抑制作用[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 30(2):193-196.

[11]謝鑫, 桑維軍, 張新強(qiáng), 等. 水楊酸誘導(dǎo)煙草抗TMV作用的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(2): 151-153.

[12]杜小鳳, 吳傳萬, 楊文飛. 等. 寡聚糖和水楊酸對黃瓜根結(jié)線蟲的防治[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2011, 27(10): 280-283.

[13]郝中娜, 文景芝, 李永鎬, 等. 非殺菌性化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)煙草抗野火病的初步研究[J]. 煙草科技, 2000, (7):45-46.

[14]王媛, 楊紅玉, 程在全. SA誘導(dǎo)擬南芥對灰霉病的抗性與木質(zhì)素含量的關(guān)系[J]. 植物保護(hù), 2007, 33(4):50-54.

[15]Malamy J, Henning J, Klessig D F. Temperature depended induction of salicylic acid and its conjugates during the resistance response to tobacco mosaic virus infection [J].Plant Cell, 1992, 4(3): 359-366.

[16]Rasmussen J B, Hammerschmidt R, Zook M N. Systemic induction of salicylic acid accumulation in cucumber after inoculation with Pseudomonas syringae pv. Syringae [J].Plant physiol, 1991, 97(4): 1342-1347.

[17]Shah J, Tsui F, Klessig D F. Characterization of a salicylic acidinsensitive mutant (sail) of Arabidopsis thaliana, identi fied in a selective screen utilizing the SA-inducible expression of the lms2 gene [J]. Mol Plant Microbe Interact, 1997, 10: 69-78.

[18]Bowling S A, Guo A, Cao H, et al. A mutation in Arabidopsis that leads to constitutive expression of systemic acquired resistance [J]. Plant Cell, 1994, 6: 1845-1857.

[19]Antoniw J F, White R F. The effects of asoirin and polyacrylic acid on soluble leaf proteins and tesistance to virus infection in five cultivars of tobacco[J]. Phytopathol Z,1980, 98(4): 331-341.

[20]Thibaud-Nissen F, Wu H, Richmond T, et al. Development of Arabidopsis wholegenome micro arrays and their application to the discovery of binding sites for the TGA2 transcription factor in salicylic acid-treated plants [J]. Plant Journal, 2006, 47(1): 152-162.

[21]Bowler C, Alliote T. The induction of mangangese superoxide dismutase in response to stress in Nicotiana plumbaginifolia [J]. The EMBO Journal, 1989, 8(1): 31-38.

[22]原永兵, 劉成連, 鞠志國. 水楊酸對蘋果葉片中過氧化氫的調(diào)節(jié)及其機(jī)制[J]. 園藝學(xué)報, 1997, 24(3): 220-224.

[23]Okuno T, Nakyama M, Okajima N, et al. Systemic resistance to downy mildew and appearance of acid soluble proteins in cucumber leaves treated with biotic and abiotic inducers [J]. Ann Phytopath Soc Japan, 1991, 57: 202-211.

[24]Reglinski T, Poole P R, Whitakr G, et al. Induced resistance against Sclerotina sclerotorum in kiwifruit leaves [J]. Plant Pathology, 1997, 46: 716-721.

[25]Bol J F, Van Kan J A. The synthesis and possible functions of virus-induced proteins in plants [J]. Microbiol Sci, 1988,5(2):47-52.

[26]Ohashi Y, Matsuoka M. Localization of pathogenesis related proteins in the epidemis and intercellular space of tobacco mosaic virus infection [J]. Plant Cell Physiol, 1987, 28(7): 1227-1235.

[27]Palva T K, Hurtig M, Saindrenan P, et al. Salicylic acid induced resistance to Erwinia carotovora subsp. carotovora in tobacco [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1994,7(3): 356-363.