郝鵬飛，黃 昀，李 勇，3，陳 娜，丁金祥，4，辛 敏，唐勁天，*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102; 2.清華大學(xué)工程物理系粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100084; 3.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070; 4.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

辣椒(Capsicum spp.)是茄科辣椒屬一年生草本植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植［1］。目前我國(guó)是世界上辣椒栽培面積最大的國(guó)家，我國(guó)辣椒的總產(chǎn)量已居世界之首，年產(chǎn)量達(dá)2800×104t，約為世界辣椒產(chǎn)量的46%，同時(shí)每年以9%的速度增長(zhǎng)［2］。但目前國(guó)內(nèi)外在采收辣椒果實(shí)后，根、莖和葉通常被當(dāng)做農(nóng)業(yè)垃圾廢棄，并沒有被有效利用，對(duì)資源造成了極大的浪費(fèi)。據(jù)相關(guān)研究辣椒葉黃酮類和多酚類化合物含量豐富［3］。其中植物葉多酚具有抗氧化、抗癌、抗過敏、防齲齒、消臭美白、降血壓和保護(hù)大腦等多種生理功能［4－6］。植物多酚作為天然抗氧化劑已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品及動(dòng)物飼料添加劑等領(lǐng)域。因此，對(duì)辣椒葉中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行研究和開發(fā)利用極具前景。本研究室李勇［7］等人利用超聲輔助提取工藝成功高效地從干燥辣椒葉中提取了辣椒葉多酚，提取物中多酚平均得率為12.11mg/g，但產(chǎn)物多酚純度較低僅為4%，不利于進(jìn)一步開發(fā)和利用。本文在前期研究基礎(chǔ)上，著重進(jìn)行了辣椒葉多酚的純化工藝研究。本研究首次建立了大孔樹脂柱層析法純化辣椒葉多酚的工藝，并對(duì)柱色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒葉 2010年10月購自四川省梓潼縣，當(dāng)年采收，通風(fēng)干燥備用;沒食子酸對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所;大孔吸附樹脂HPD－100、HPD400、HPD－450、HPD－600、HPD－750、HPD－722、HPD－826、D101、DM130、ADS－7、ADS－17、AB－8、NKA－9、X－5滄州寶恩化工有限公司;無水乙醇北京化工廠，分析純;液體和固體試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，超純水美?guó)Barnstead Easypure超純水系統(tǒng)。

WF2 UV－2000型紫外可見分光光度儀 尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、R510型鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FDU－2100型冷凍干燥器EYELA(日本產(chǎn));DZF－6050型真空干燥箱北京神泰偉業(yè)儀器有限公司;MOOEL ESJ－6020型電子分析天平梅特勒—托利多(上海)有限公司;Milli－Q Academic型超純水系統(tǒng)美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒葉提取液的制備 稱取辣椒葉1200g，60%乙醇(pH1)作為提取溶劑，料液比1∶30，在45℃下超聲波輔助提取40min，合并濾液，濃縮，冷凍干燥即得。用前新鮮配制成相應(yīng)濃度的多酚粗提物水溶液［7］(下文簡(jiǎn)稱“粗提液”)。

1.2.2 線性關(guān)系及回歸方程 精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.00mg，置于50mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此溶液10mL，加入25mL棕色容量瓶中稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液(沒食子酸濃度36.184μg/mL)。然后分別精確吸取沒食子酸對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，加入25mL棕色容量瓶中，加1.0mL磷鉬鎢酸溶液和13mL超純水，再用29%飽和碳酸鈉溶液緩慢稀釋至刻度，搖勻，靜置反應(yīng)30min，同時(shí)做空白對(duì)照。以765nm處的最大吸光度作為沒食子酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

1.2.3 供試溶液多酚含量測(cè)定 準(zhǔn)確量取供試溶液1.0mL，置于50mL的棕色容量瓶中，加水緩慢稀釋至刻度，搖勻。再從中精密量取1.0mL，置于25mL棕色容量瓶中，按照1.2.2方法，從“加1.0mL磷鉬鎢酸溶液”起，測(cè)定吸光度A，代入回歸方程，以沒食子酸為當(dāng)量計(jì)算出供試液中多酚含量。

1.2.4 靜態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)優(yōu)選大孔樹脂 稱取14種已經(jīng)預(yù)處理的大孔吸附樹脂各2g于100mL具塞錐形瓶中，加入50mL辣椒葉多酚粗提液(多酚濃度C0為1.611mg/mL)，放置于搖床上，25℃，87r/min振搖2h，靜置10h，減壓抽濾，測(cè)定濾液中多酚濃度Ce。將濾出的大孔樹脂抽干，置于100mL具塞錐形瓶中，加入50mL 70%乙醇溶液置于搖床上，25℃，87r/min振搖2h，靜置2h，進(jìn)行靜態(tài)解吸，并測(cè)定解吸液多酚濃度Cd。分別按照以下公式計(jì)算14種不同樹脂的靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率。

吸附量(mg/g干樹脂)=(C0－Ce)×V0/m;

吸附率(%)=(C0－Ce)×100/C0;

解吸率(%)=Cd×100/(C0－Ce)。

其中m為樹脂質(zhì)量(g);V0為初始辣椒葉多酚粗提液體積(mL)。

1.2.5 色譜條件優(yōu)化研究

1.2.5.1 上樣溶液濃度考察 量取粗提液(多酚含量為1.753mg/mL)200mL，分別加水稀釋至多酚含量為1.197、0.603、0.353mg/mL，分別上樣于預(yù)裝的大孔樹脂柱(36g;3cm×18cm;床體積約為85mL)，以2BV/h (床體積/小時(shí))流速進(jìn)行吸附，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量，計(jì)算出吸附量。

1.2.5.2 樹脂柱徑高比考察 分別裝填徑高比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8的大孔樹脂色譜柱，并以2BV/h流速進(jìn)行吸附(多酚質(zhì)量濃度為0.833mg/mL)，上樣量為3BV，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量，計(jì)算出吸附量。

1.2.5.3 吸附速率的考察 量取粗提液(多酚濃度為0.860mg/mL)250mL，吸附于85mL(徑高比為1∶4) HPD－100樹脂柱上，分別以1、2、3、4BV/h的流速進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量，計(jì)算出吸附量。

1.2.5.4 上樣量的考察 分別量取粗提液(多酚濃度為0.915mg/mL)1、3、5、7、9、11、13、15、17、18、19、20、21、22BV，上樣于床體積為85mL的HPD－100樹脂柱，以2BV/h流速進(jìn)行吸附，收集未能吸附在柱上的流出液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量。

1.2.5.5 洗脫劑乙醇濃度的考察 量取粗提液(多酚濃度為0.866mg/mL)250mL，上樣于床體積為85mL的HPD－100樹脂柱，以3BV/h流速進(jìn)行吸附，再用3BV/h流速水洗5BV后，分別用體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液洗脫，流速為2BV/h，洗脫劑用量250mL。收集洗脫液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量，計(jì)算出解析率。

1.2.5.6 洗脫劑用量的確定 將吸附飽和的樹脂用70%乙醇，以2BV/h的速度進(jìn)行洗脫，以1BV為單位分別收集洗脫液，直至洗脫劑用量達(dá)到7BV。按1.2.3方法測(cè)算多酚含量。

1.2.5.7 水洗體積的考查 用超純水以5BV/h的流速洗脫吸附飽和的樹脂上未吸附的多酚提取液，一次加入1BV的蒸餾水，共加8次，分別收集每一次的洗脫液，按1.2.3方法測(cè)算多酚含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及回歸方程

以1.2.2方法測(cè)定沒食子酸線性關(guān)系，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.1024x+0.0432，R2= 0.9999?？芍瑳]食子酸濃度在1.648～8.240μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合檢測(cè)要求。

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)

以1.2.4方法對(duì)大孔樹脂靜態(tài)吸附－解吸情況進(jìn)行考察，結(jié)果見表1。

從表1可知，HPD－750、HPD－100、ADS－7和HPD－722型號(hào)樹脂對(duì)辣椒葉多酚具有較強(qiáng)的吸附性能，NKA－9、X－5、HPD－722和HPD－100等解析率效果比較好。綜合考慮，其中HPD－100樹脂具有較高的吸附率和解吸率。因此，選擇HPD－100樹脂純化辣椒葉多酚。

表1 14種大孔樹脂靜態(tài)吸附－解吸情況Table 1 The static adsorption－desorption characteristic of fourteen types of macroporous resin

2.3 色譜條件優(yōu)化研究

2.3.1 上樣濃度的考察 以1.2.5.1方法對(duì)上樣濃度進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，在一定的低濃度范圍內(nèi)(＜0.603mg/mL時(shí))，樹脂的吸附量隨上樣濃度增大而增加。而濃度過高時(shí)，樹脂的吸附量開始下降。當(dāng)藥液濃度達(dá)到1.197mg/mL時(shí)，其吸附量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。可能是由于濃度過高使得吸附時(shí)間變長(zhǎng)，從而造成一部分先吸附的多酚被后面的樣品洗脫下來。因此確定上樣的辣椒葉多酚粗提液濃度為應(yīng)該在0.603～1.197mg/mL之間。

圖1 上樣濃度的考察Fig.1 Investigation of the sample concentration

2.3.2 樹脂柱徑高比例考察 以1.2.5.2方法對(duì)樹脂柱徑高比例進(jìn)行考察，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，徑高比在1∶2～1∶4之間吸附量保持穩(wěn)定，但到1∶6時(shí)吸附量急速減少。推測(cè)是因?yàn)闃渲^高，吸附時(shí)間相應(yīng)變長(zhǎng)，導(dǎo)致先吸附的多酚被洗脫下來。且增加徑高比也會(huì)使樹脂的堵塞加劇，對(duì)生產(chǎn)不利。綜上分析，最適徑高比為1∶4。

2.3.3 吸附速率的考察 以1.2.5.3方法對(duì)吸附速率進(jìn)行考察，結(jié)果見圖3。

從圖3得知，當(dāng)吸附速率增加時(shí)，其吸附率逐步下降。當(dāng)吸附速率為3BV/h時(shí)，吸附率明顯減少。推測(cè)的原因是:上樣液流速過大時(shí)，辣椒葉多酚粗提液中的多酚類物質(zhì)還未擴(kuò)散到大孔吸附樹脂的內(nèi)表面，就已經(jīng)被沖出柱子;而吸附流速太慢時(shí)，導(dǎo)致純化效率過低。因此，較優(yōu)的吸附速率為2BV/h。

圖2 樹脂柱徑高比例考察Fig.2 Investigation of the resin column diameter to height ratio

圖3 吸附速率的考察Fig.3 Investigation of the adsorption rate

2.3.4 上樣量的考察 以1.2.5.4方法對(duì)上樣量進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4。

從圖4可知，上樣量從15BV開始，泄露速度趨于穩(wěn)定，即15～20BV之間多酚的吸附和解析達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。因此確定上樣量為15BV時(shí)，樹脂柱已經(jīng)達(dá)到吸附飽和。故確定最佳的上樣體積為15BV。

圖4 上樣量的考察Fig.4 Investigation of the sample volume

2.3.5 洗脫劑濃度的考察 以1.2.5.5方法對(duì)洗脫劑濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖5。

從圖5可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸率達(dá)到最大(96.5%)，此時(shí)洗脫效果最好。

2.3.6 洗脫劑用量的考察 以1.2.5.6方法對(duì)洗脫劑用量進(jìn)行考察，結(jié)果如圖6。

從圖6可以看出，洗脫劑用量達(dá)到3BV時(shí)，多酚的洗脫速率基本達(dá)到平衡，考慮節(jié)約生產(chǎn)中的成本的問題，選取3BV洗脫劑用量較佳。

圖5 洗脫劑濃度的考察Fig.5 Investigation of the eluent concentration

圖6 洗脫劑用量的考察Fig.6 Investigation of the amount of eluent

2.3.7 水洗體積的考察 以1.2.5.7方法對(duì)水洗體積進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7。

從圖7得知，當(dāng)用水量達(dá)到3BV時(shí)，可將樹脂上絕大部分未吸附的多酚溶液洗脫出來，因此水洗量宜選擇3BV。

圖7 水洗體積的考察Fig.7 Investigation of the washing volume

2.4 最佳純化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，按照上述實(shí)驗(yàn)所得最佳工藝(樹脂柱徑高比為1∶4，藥液質(zhì)量濃度在0.6～1.2g/mL之間，吸附速率2BV/h，上樣量15BV，上樣后先用3BV體積超純水以5BV/h的流速洗脫除去未吸附的雜質(zhì)，再用3BV的70%乙醇洗脫)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，多酚含量依次為66.832%、69.973%、67.211%，平均多酚含量約為68%，說明在此工藝條件下多酚純度較高，重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

經(jīng)過對(duì)14種大孔樹脂的篩選，最終采用HPD－100對(duì)辣椒葉多酚粗提物進(jìn)行純化。其最佳吸附條件為:樹脂柱徑高比為1∶4，藥液質(zhì)量濃度在0.6～1.2mg/mL之間，吸附速率2BV/h，上樣量15BV。在以上條件下，最佳洗脫條件為:先用3BV體積超純水以5BV/h的流速洗脫除去未吸附的雜質(zhì)，再用3BV的70%乙醇洗脫。經(jīng)上述條件處理后的辣椒葉多酚含量可達(dá)到68%。該法簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)周期短、成本低、所得多酚純度高、比較完整的保存了多酚天然的生物活性，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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