高慧娟，楊霞霞，杜學基，蘇鳳賢，張芬琴，席亞麗，魏生龍

(1.河西學院食用菌研究所，甘肅張掖734000; 2.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅張掖734000)

荷葉離褶傘是一種珍稀的野生食用菌，蛋白質含量高、氨基酸種類齊全，具有很高的營養(yǎng)價值［1］。由于其野生子實體數(shù)量較少，目前人工規(guī)模化栽培技術還不很成熟［2］，而采用液態(tài)發(fā)酵技術可以獲得大量的菌絲體。研究表明，荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質的均衡性優(yōu)于子實體，營養(yǎng)價值比子實體更高，且極具生產(chǎn)和食用價值［3］。硒作為人體必需的微量元素，能激發(fā)人體免疫球蛋白及抗體的產(chǎn)生，具有抗衰老作用［4］。食用菌因具有較強的富硒能力［5］，將其在添加了Na2SeO3的培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵，通過菌絲細胞內(nèi)物質代謝，使無機硒安全有效地轉化為有機硒多糖和硒蛋白，大大提高食用菌的營養(yǎng)價值和應用范圍。本研究以液體發(fā)酵培養(yǎng)的方式制備富硒荷葉離褶傘菌絲體，通過單因素和正交實驗，探討滅菌條件、加硒濃度，發(fā)酵時間和添加硒時間，對荷葉離褶傘生物量和富硒量的影響，初步確定荷葉離褶傘的最佳富硒發(fā)酵培養(yǎng)條件，以期對荷葉離褶傘菌絲體富硒研究提供一定的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉離褶傘 由河西學院食用菌研究所提供; Na2SeO3、KH2PO4、MgSO4等化學試劑 均為國產(chǎn)分析純;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO41g，加水定容至1000mL。

S70－CJ－18U潔凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LGJ－18冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;DHG－9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;LDZX－50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;ZHWY－200B恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化培養(yǎng) 將荷葉離褶傘母種菌絲塊接入新鮮固體培養(yǎng)基上，置于22℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)15d后，再轉接一次，22℃培養(yǎng)15d，備用。

1.2.2 硒對荷葉離褶傘菌絲體生長和富硒量的影響 研究培養(yǎng)基滅菌條件、硒添加濃度、發(fā)酵時間和添加硒的時間對富硒菌絲體干重和富硒量的影響，再采用正交實驗法優(yōu)化最佳富硒條件。

1.2.2.1 發(fā)酵液中硒濃度范圍選擇 在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基和Na2SeO3溶液，使硒在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90μg/mL，每個濃度設三個平行對照，121℃滅菌20min。冷卻至室溫后，每瓶接入6片直徑為6mm的菌絲塊，置于121r/min，22℃的恒溫培養(yǎng)震蕩器上培養(yǎng)12d。測定菌絲體干重，以確定發(fā)酵液中添加硒濃度的范圍。

1.2.2.2 發(fā)酵液中硒濃度對富硒菌絲體干重及富硒量的影響 在250mL三角瓶中，加入100mL的基礎培養(yǎng)基和一定量的Na2SeO3，使硒在培養(yǎng)基中的終濃度為0、1、2、4、5、6、8、10μg/mL，每個濃度設三個平行對照，121℃滅菌20min。冷卻至室溫后，接入6片直徑為6mm的菌絲塊，置于恒溫搖床(121r/min，22℃)上培養(yǎng)12d，測定菌絲體干重和富硒量，以確定富硒菌絲體最佳添加硒的濃度。

1.2.2.3 滅菌條件對富硒荷葉離褶傘菌絲體干重的影響 在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基，在每個瓶中加入 Na2SeO3，使硒的終濃度為10μg/mL，分別在 115℃、20min，115℃、30min，121℃、20min和121℃、30min的條件下滅菌，每個滅菌條件設三個平行對照。冷卻至室溫后每瓶接入6塊直徑為6mm的菌絲塊，置于121r/min，22℃的恒溫搖床培養(yǎng)12d。測定菌絲體干重，以確定富硒菌絲體的最佳滅菌條件。

1.2.2.4 發(fā)酵時間對富硒菌絲體干重及富硒量的影響 在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基，在每個瓶中加入 1.2.2.2中最佳硒濃度的量，在1.2.2.3的最佳滅菌條件下滅菌，冷卻至室溫后，接入6片直徑為6mm的菌絲塊，置于恒溫搖床(121r/min，22℃)上培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別設定為7、9、11、12、13、15、16d，同一培養(yǎng)時間設定三個重復，測定菌絲體干重和富硒量。

1.2.2.5 硒添加時間對荷葉離褶傘菌絲體干重及富硒量的影響 在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基，分別在發(fā)酵的第0、2、4、5、6、8、10、11d，加入1.2.2.2中最佳硒濃度，同一加入時間設定三個重復，在1.2.2.3的最佳滅菌條件下滅菌，冷卻至室溫后接入6片直徑為6mm的菌絲塊，置于恒溫搖床(121r/min，22℃)上培養(yǎng)測定菌絲體干重和富硒量。

1.2.2.6 荷葉離褶傘菌絲體富硒條件的正交實驗設計 在單因素實驗基礎上，為了獲得荷葉離褶傘菌絲體對硒富集的最佳工藝條件，利用正交實驗法，以發(fā)酵液中添加硒濃度、滅菌條件、硒的添加時間和發(fā)酵時間作為考察因素，選取3個水平進行實驗。采用L9(34)正交表進行正交實驗設計，設計因素水平表見表1。將對應的各因素進行填入表2，按表2安排的條件進行實驗，每個處理3個重復，同時以不加入Na2SeO3發(fā)酵液為對照，確定最佳富集硒工藝條件。

表1 荷葉離褶傘富集無機硒正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for L9(34)orthogonal array design of Lyophyllum decastes

1.2.3 菌絲體干重的測定 搖床培養(yǎng)結束后，將100mL發(fā)酵液經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，蒸餾水反復洗滌菌球后，置于真空冷凍干燥機中冷凍至干燥，稱重即得菌絲體干重［6］。

1.2.4 富硒量和富硒率的測定 采用亞甲藍還原法進行測定［7］。取7支試管，分別加入0.1mg/mL的Na2SeO3溶液0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0mL，加蒸餾水定容至10mL。再依次加入掩蔽劑5mL，甲醛5mL，堿性硫化物1mL和0.005%亞甲基藍2滴，置于31℃水浴中觀察褪色時間。以時間的倒數(shù)為橫坐標，硒濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.1 富硒量的測定 取0.3mL發(fā)酵液，加入9.7mL蒸餾水，再依次加入掩蔽劑5mL，甲醛5mL，堿性硫化物1mL和0.005%亞甲基藍2滴，置于31℃水浴中觀察褪色時間，從標準曲線上讀出硒含量。用培養(yǎng)液中加入的硒量減去測得的剩余硒含量，即為菌絲體富硒量。

1.2.4.2 富硒率的計算 富硒率的計算:

其中:X1表示富硒菌絲體中硒含量(μg/g)，X2表示空白菌絲體硒含量(μg/g)，m1表示富硒菌絲體干重(g)，m0表示添加于培養(yǎng)基中的硒含量(g)。

1.2.4.3 隸屬度的計算［8］正交結果中有菌絲體干重和富硒量兩個指標，將兩個指標轉化為隸屬度，隸屬度的計算方法如下:

1.2.4.4 隸屬度綜合分的計算 將富硒量和菌絲體干重的權重分別取0.6和0.4，計算得隸屬度綜合分=干重量隸屬度×0.4+富硒量隸屬度×0.6。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液中硒濃度范圍的選擇

由圖1可知，Na2SeO3濃度在0～80μg/mL時，荷葉離褶傘均能生長，且隨著硒濃度的增加，菌絲體干重量減少。當硒濃度等于10μg/mL時，菌絲體干重量降低至空白對照組的0.41倍，硒濃度在10～80μg/mL時，菌絲體干重量下降較為平緩。說明荷葉離褶傘發(fā)酵液中添加Na2SeO3對其菌絲體生長有抑制作用，其大小取決于硒濃度，硒濃度越大這種抑制作用越強。而且培養(yǎng)基的顏色隨著Na2SeO3濃度的增加，呈現(xiàn)淡粉色到粉紅色的變化，說明滅菌會促使Na2SeO3還原為硒單質，因此從生產(chǎn)富硒荷葉離褶傘的角度考慮，培養(yǎng)基中的Na2SeO3的濃度應低于10μg/mL，最終確定擇硒濃度0～10μg/mL為硒最佳添加量。

表2 滅菌條件對荷葉離褶傘菌絲體的影響Table 2 Effect of sterilization conditions on mycelia of Lyophyllum decastes

圖1 硒濃度對荷葉離褶傘菌絲體生長速率的影響Fig.1 Effect of Selenium concentration on mycelia growth rate of Lyophyllum decastes

2.2 發(fā)酵液中硒濃度對富硒菌絲體干重及富硒量的影響

測定發(fā)酵液中留存的無機硒的含量，標準曲線如圖2所示，以硒含量為縱坐標，褪色時間的倒數(shù)為橫坐標作圖，得到回歸方程為y=1708.1x－1.5571，R2=0.9945。

圖2 硒含量標準曲線Fig.2 The standard curve of selenium content

為了選擇合適的 Na2SeO3濃度，進一步將添加的Na2SeO3量細化，測定荷葉離褶傘菌絲體干重、富硒量和富硒率，結果見圖3。

由圖3可知，發(fā)酵液中添加Na2SeO3濃度會使荷葉離褶傘菌絲體干重下降，而所有處理組相比，其菌絲體干重又隨著Na2SeO3濃度增加，出現(xiàn)小幅先增加后降低的趨勢。當Na2SeO3濃度為5μg/mL時，菌絲體干重達到最大值，為0.5783g/100mL，隨著濃度的進一步增加，菌絲體干重又開始下降。其中即使富硒菌絲體干重的最大值仍低于未添加Na2SeO3組菌絲體干重，其機理有待進一步研究。于此同時，檢測隨著Na2SeO3濃度的增加，荷葉離褶傘菌絲體富硒量和富硒率呈現(xiàn)先顯著升高后略有下降低的變化趨勢，其中Na2SeO3濃度為5μg/mL時，菌絲體中的富硒率達到最大值77.86%;而富硒量在Na2SeO3濃度為6μg/mL時達到最大值0.7864mg/g。綜合菌絲體干重和富硒量的結果，選擇 Na2SeO3的濃度為5μg/mL作為發(fā)酵的最佳濃度。

圖3 發(fā)酵液中硒濃度對富硒菌絲體干重及富硒量的影響Fig.3 Effect of concentration of sodium selenite on mycelia dry weight and Selenium content of Lyophyllum decastes

2.3 滅菌條件對富硒荷葉離褶傘菌絲體干重和富硒量的影響

不同滅菌條件可能影響荷葉離褶傘菌絲體生長，為了確定上述觀點，設定不同滅菌條件，觀察培養(yǎng)基的顏色和測定菌絲體干重，結果見表2。

由表2可以看出，隨著滅菌溫度的增加和時間的延長，培養(yǎng)基的顏色由淺黃色色逐漸變?yōu)榉奂t色。當采用115℃、20min的滅菌條件時，菌絲體干重和富硒量達到最大，為0.3510g/100mL和0.3618mg/g，且污染率為0。說明在高溫長時間的滅菌條件下，PDA培養(yǎng)基質中的無機硒，會被氧化成硒單質，變?yōu)榉奂t色［9］，單質硒的存在不利于荷葉離褶傘菌絲對硒的富集，但是有利于菌絲體干重的積累，說明單質硒對菌絲體的毒害作用較小。結合滅菌條件對荷葉離褶傘菌絲體干重和富硒量的影響，選擇115℃、20min的滅菌條件為最佳滅菌條件。

2.4 發(fā)酵時間對富硒菌絲體干重及富硒量的影響

在最優(yōu)滅菌條件和加硒濃度已經(jīng)確定的情況下，研究發(fā)酵時間對荷葉離褶傘菌絲體干重和富硒量的影響，結果見圖4。

由圖4可知，菌絲體干重隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并于發(fā)酵12d時達到最大0.4893g/100mL;而菌絲體對硒的富集量和富硒率隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律與菌絲體干重呈現(xiàn)相同的趨勢，也在發(fā)酵的第12d達到最大，分別為1.1063mg/g和76.95%。以上結果表明，在硒濃度不變的情況之下，隨著發(fā)酵時間的延長，菌絲體開始生長速度增加，待菌絲體干重量達到最大后，菌絲體逐漸老化、溶解，干重量又逐漸減少。因此確定發(fā)酵的最佳時間為12d。

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

圖4 不同發(fā)酵時間對菌絲體干重和富硒量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on mycelia dry weight and selenium content of Lyophyllum decastes

2.5 硒添加時間對荷葉離褶傘菌絲體干重及富硒量的影響

在發(fā)酵的不同時間內(nèi)加入Na2SeO3，觀察添加時間對荷葉離褶傘菌絲體干重、富硒量和富硒率的影響結果見圖5。

由圖5可知，隨著硒添加時間的延長，荷葉離褶傘菌絲體干重、富硒量和富硒率出現(xiàn)先增加后降低的開口向下的拋物線形狀，在發(fā)酵的第6d加入Na2SeO3后，菌絲體干重達到最大值0.8171g/100mL，而菌絲體富硒量在第5d加入后達到0.742mg/g的最大量，在第5d和第6d加入Na2SeO3對富硒率的影響不大。綜上，選擇發(fā)酵第5d添加Na2SeO3為富硒培養(yǎng)實驗中最佳加硒時間。

圖5 硒添加時間對富硒菌絲體干重量和富硒量的影響Fig.5 Effect of add time of Na2SeO3on mycelia dry weight and selenium concent of Lyophyllum decastes

2.6 荷葉離褶傘菌絲體富硒條件的正交實驗

按表1的設計，進行正交實驗，由于菌絲體干重和富硒量兩個指標的重要性不一樣，要得到富硒的荷葉離褶傘菌絲體，既要得到高的富硒量，還要得到多的菌絲體，故而將富硒量和菌絲體干重權重分別取0.6和0.4，每個實驗號的隸屬度綜合分數(shù)作為總指標進行直觀分析，即綜合分=干重量隸屬度×0.4 +富硒量隸屬度×0.6，所以在進行條件優(yōu)化時只采用隸屬度綜合分為指標計算K值，結果見表3。

從正交結果來看，加入Na2SeO3的濃度對實驗影響最大，其次為Na2SeO3添加時間，最后為發(fā)酵時間。最優(yōu)富硒培養(yǎng)條件為:A1C2D3B3，即:培養(yǎng)基滅菌條件為115℃、20min，加硒濃度為4μg/mL，在發(fā)酵的第5d加入Na2SeO3，發(fā)酵13d。

實驗中最佳的培養(yǎng)條件組合沒有出現(xiàn)在正交表中，按照上述分析得到的最佳富硒條件進行驗證，結果得到的菌絲體的干重量達到0.8232g/100mL，富硒量達到0.7040mg/g，較正交實驗中每組結果都高，說明此條件是發(fā)酵過程中得到荷葉離褶傘菌絲體的最佳富硒條件。

3 結論與討論

荷葉離褶傘菌絲體具有一定的富硒能力，在發(fā)酵開始時加入Na2SeO3對荷葉離褶傘菌絲體生長具有抑制作用，這種抑制隨著Na2SeO3的濃度的增加呈現(xiàn)增加趨勢;對Na2SeO3分別在發(fā)酵的不同時間添加，隨著添加時間的延長，菌絲體干重量和富硒量呈現(xiàn)先增加而后降低的趨勢，而且菌絲體干重較空白對照增加明顯;不同滅菌條件也影響荷葉離褶傘菌絲體的富集硒的能力;說明在荷葉離褶傘富硒的發(fā)酵過程中，發(fā)酵條件可以有效的提高菌絲體的干重和富硒量。

在單因素實驗的基礎上，進行正交實驗，優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基滅菌條件為115℃、20min，加硒濃度4μg/mL，在發(fā)酵的第5d加入Na2SeO3，發(fā)酵 13d，得到菌絲體干重和富硒量分別為0.8232g/100mL和0.7040mg/g，其中菌絲體干重較不加硒的空白培養(yǎng)基中增加了11%，這可為今后荷葉離褶傘菌絲體富硒的食品或藥品的開發(fā)研究提供理論支持，具有一定的現(xiàn)實意義。

荷葉離褶傘菌絲體能將無機硒轉化為有機硒，提高人們對硒的攝入的安全性，同時可以提高荷葉離褶傘的利用附加值，具有廣闊的應用前景。

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