熊新，張曉峰，穆立偉，王夢(mèng)蕾，楊金龍，張博，莽九旺，鄧亞軍

（1.北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101318；2.中國畜牧業(yè)協(xié)會(huì)犬業(yè)分會(huì)，北京 100028）

·技術(shù)與應(yīng)用·

藏獒16個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性

熊新1，張曉峰2，穆立偉1，王夢(mèng)蕾1，楊金龍1，張博1，莽九旺1，鄧亞軍1

（1.北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101318；2.中國畜牧業(yè)協(xié)會(huì)犬業(yè)分會(huì)，北京 100028）

目的 通過對(duì)449頭藏獒的16個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究，建立藏獒的基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。方法選用犬熒光標(biāo)記16個(gè)STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果449頭藏獒的16個(gè)STR基因座累積個(gè)體識(shí)別率為0.999 999 999 999 999，累積非父排除率為0.999997795，除FH2010（等位基因數(shù)10）、PEZ21（等位基因數(shù)12）、PEZ05（等位基因數(shù)13）外，其余STR基因座的等位基因數(shù)均在15個(gè)以上；16個(gè)STR基因座的雜合度均＞0.5，多態(tài)信息含量均＞0.7。結(jié)論16個(gè)犬STR基因座在藏獒中具有較高的個(gè)體識(shí)別能力，可用于藏獒的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。通過本研究獲得的各種數(shù)據(jù)，可用于建立藏獒的DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。

法醫(yī)遺傳學(xué)；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；短串聯(lián)重復(fù)序列；藏獒

隨著DNA分析技術(shù)的發(fā)展，法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的應(yīng)用從人不斷擴(kuò)展到動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物領(lǐng)域。而養(yǎng)殖、繁育、買賣藏獒已經(jīng)是近年來人們關(guān)注的重點(diǎn)，因此而產(chǎn)生的產(chǎn)業(yè)鏈每年交易額高達(dá)十億元，一頭品相俱佳的藏獒，成交額可高達(dá)千萬元。但是在藏獒的繁育和交易過程中，人們迫切希望能夠通過DNA檢測(cè)，對(duì)交易的藏獒進(jìn)行身份認(rèn)定或親權(quán)鑒定，以確定藏獒的父方、母方是否品種純正，這也是國際犬業(yè)協(xié)會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

國內(nèi)已有一些利用STR基因座對(duì)犬進(jìn)行遺傳學(xué)的研究，王海生等[1]對(duì)湖北地區(qū)德國牧羊犬10個(gè)微衛(wèi)星DNA基因座遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，徐波等[2]對(duì)純種犬在15個(gè)STR基因座上的遺傳多態(tài)性及親權(quán)鑒定方面進(jìn)行了研究。本研究選擇了由16個(gè)犬類STR基因座組成的熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，并檢測(cè)449頭藏獒STR基因座的遺傳多態(tài)性，以期為藏獒的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定提供方法，為親緣鑒定和同一認(rèn)定提供數(shù)據(jù)，順利建立藏獒的DNA數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

449份取自2011年沈陽藏獒新秀賽A級(jí)純種健康藏獒口腔拭子樣本。

1.1.2 主要儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀，3130XL遺傳分析儀均購自美國AB公司。InteliGene Search Dog STR熒光檢測(cè)試劑盒購自北京玉衡普泰科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

采用Chelex-100法[3]對(duì)藏獒個(gè)體口腔拭子樣本進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 PCR復(fù)合擴(kuò)增

選用InteliGene Search Dog STR熒光檢測(cè)試劑盒（PEZ01、PEZ06、PEZ08、PEZ16、PEZ03、PEZ11、FH2010、PEZ12、PEZ05、PEZ20、PEZ17、FH2079、PEZ21、FH2054、PEZ15、PEZ13）。擴(kuò)增采用10 μL體系，內(nèi)含：4 μL反應(yīng)混合液，2 μL Dog STR引物混合液，1 μL熱啟動(dòng)Taq酶，1 ng模板DNA，去離子水補(bǔ)至10μL。在9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃11min；94℃45s，55℃60s，72℃60s，31個(gè)循環(huán)；60℃60min。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物以離心半徑5cm，3000r/min，離心3min，取1μL產(chǎn)物與0.5μL Marker-500內(nèi)標(biāo)和9μL去離子甲酰胺混合，95℃變性3min后冰浴，3130XL遺傳分析儀電泳檢測(cè)。采用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)各基因座等位基因數(shù)目、雜合子數(shù)目計(jì)算16個(gè)STR基因座的各基因型頻率、等位基因頻率、匹配概率（Pm）、雜合度（H）、個(gè)體識(shí)別率（DP）以及各基因座累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）、多態(tài)信息含量（PIC）、累積非父排除率（CPE）和非父排除率（PE）等群體遺傳學(xué)參數(shù)，并對(duì)頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

對(duì)449頭純種藏獒的16個(gè)STR基因座進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，均得到較好的分型結(jié)果。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，P＞0.05。各基因座的等位基因及其頻率分布見表1。根據(jù)基因型檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算得到各基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果表明，該16個(gè)STR基因座均具有較高的遺傳多態(tài)性，平均H為0.775，平均PIC為0.841，CDP達(dá)到0.999 999 999 999 999，CPE達(dá)到0.999997795。

表1 藏獒16個(gè)STR基因座等位基因頻率分布（n=449）

續(xù)表1

表2 藏獒16個(gè)STR基因座群體遺傳學(xué)參數(shù)

3 討論

等位基因數(shù)目反映了某個(gè)基因座在進(jìn)化過程中所積累的遺傳變異，等位基因數(shù)量越多說明在進(jìn)化史上這個(gè)基因座突變?cè)交钴S，導(dǎo)致物種在自然選擇中發(fā)展的取向越多，對(duì)生活環(huán)境適應(yīng)的潛能越大。同時(shí)遺傳學(xué)參數(shù)中的H和PIC在評(píng)價(jià)物種多樣性上有很重要的意義。H是用來定量評(píng)估一個(gè)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性程度的，也就是群體中雜合子的頻率。PIC是評(píng)價(jià)基因座多態(tài)性的一個(gè)量化概念，是指在某一家系中可以利用基因座多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因連鎖分析的概率。與H一樣，標(biāo)記基因座的等位基因數(shù)越多，各等位片段頻率越均勻，PIC越大[4-5]。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)基因座；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)基因座；當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，該基因座為低度多態(tài)基因座[6]。

本研究選擇的16個(gè)STR基因座的PIC值均在0.7以上，H也在0.5以上，均屬于高度多態(tài)性的基因座。所有基因座均有10個(gè)以上等位基因，其中PEZ13這個(gè)基因座的等位基因數(shù)目高達(dá)50個(gè)。FH2010的等位基因數(shù)最少為10個(gè)，在這16個(gè)犬STR基因座中，等位基因數(shù)目大于15個(gè)的有13個(gè)，表明這16個(gè)STR基因座具有高度的遺傳多態(tài)性。通過數(shù)據(jù)比對(duì)，本實(shí)驗(yàn)中各基因座的PIC值和DP值（除PEZ16外）均高于王海生等[1，7]報(bào)道的數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了449頭藏獒的樣本，這些藏獒的源頭基本都來自青海玉樹地區(qū)，來源基本穩(wěn)定，到內(nèi)地經(jīng)過繁殖、交配和交易，存在參賽藏獒中有可能來自同一父系或同一母系的情況。本實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)：（1）8對(duì)樣本的分型完全一致，核對(duì)信息發(fā)現(xiàn)，這8對(duì)藏獒的名字、毛色和性別等信息完全一致，但編號(hào)不同，可能為同一只藏獒重復(fù)編號(hào)所致；（2）另1對(duì)樣本的分型一致，核對(duì)信息后發(fā)現(xiàn)其毛色和性別也一致，但名字不同且分別屬于不同犬主，分析認(rèn)為可能存在同卵雙生關(guān)系；（3）另10對(duì)樣本具有明確的親子關(guān)系。由于這類具有明確親緣關(guān)系的藏獒樣本的存在，在進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡驗(yàn)證時(shí)出現(xiàn)了部分基因座不符合的現(xiàn)象。

本研究使用的試劑盒為國內(nèi)公司研制的含有16個(gè)STR基因座的熒光標(biāo)記試劑盒，其CPE和CDP均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目前美國AB公司同類商品化試劑盒的能力，可有效應(yīng)用于犬的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。而且藏獒類親緣鑒定、同一認(rèn)定等所需的基因頻率等數(shù)據(jù)，均為純種藏獒專用數(shù)據(jù)。本研究中群體樣本較大，通過實(shí)驗(yàn)獲得的各種數(shù)據(jù)包括基因頻率等，都可協(xié)助用于進(jìn)行純種藏獒數(shù)據(jù)庫的建立。但不同犬種、不同品系之間是否存在差別，需要增加品系和樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]王海生，王祥，張文平，等.湖北地區(qū)德國牧羊犬10個(gè)微衛(wèi)星DNA基因座遺傳多態(tài)性研究[J].刑事技術(shù)，2003，（2）：12-14.

[2]徐波，熊勇華，涂祖新，等.純種犬在15個(gè)STR基因座上的遺傳多態(tài)性[J].生物技術(shù)，2006，16（2）：28-31.

[3]吳微微，鄭秀芬.一種改良Chelex方法提取血痕DNA[J].刑事技術(shù)，1999，（1）：20-21.

[4]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002：384-385.

[5]侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：21-22.

[6]Ladon D，Schelling C，Dolf G，et al.The highly polymorphic canine microsatellite ZuBeCa6 is localized on canine chromosome 5q12-q13[J].Anim Genet，1998，29（6）：466-467.

[7]金鑫，凃政，姜成濤，等.藏獒犬11個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（1）：39-42.

Genetic Polymorphisms of 16 STR Loci in Tibetan Mastiff

XIONG Xin1,ZHANG Xiao-feng2,MU Li-wei1,WANG Meng-lei1,YANG Jin-long1,ZHANG Bo1,MANG Jiu-wang1,DENG Ya-jun1
（1.Center of Forensic Science,Beijing Genomics Institute,Beijing 101318,China;2.China Animal Agriculture Association National Kennel Club,Beijing 100028,China）

ObjectiveTo explore the genetic polymorphisms of 16 STR loci from 449 Tibetan Mastiffs in order to set up gene polymorphism database of Tibetan Mastiff.MethodsThe PCR amplification was performed using the 16 STR loci fluorescent multiple amplification kit for dog.The amplified products were detected and statistically analyzed.ResultsIn the 16 STR loci from 449 Tibetan Mastiffs,CDP was 0.999999999999999 and CEP was 0.999997795.Except FH2010（10 alleles）,PEZ21（12 alleles）, and PEZ05（13 alleles）,the other STR loci had more than 15 alleles.In the 16 STR loci,H was>0.5 and PIC was>0.7.ConclusionThe 16 STR loci have high polymorphism to be suitable for individual identification and paternity testing of Tibetan Mastiff.The data obtained through this study can be used to establish DNA polymorphism database of Tibetan Mastiff.

forensic genetics;polymorphism,genetic;short random repeats;Tibetan Mastiff

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.012

1004-5619（2013）04-0282-04

2012-08-09）

（本文編輯：李成濤）

熊新（1982—），男，北京人，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)工作；E-mail：13810088725@139.com

鄧亞軍，女，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)工作；E-mail：dengyj@genomics.org.cn