汪 洋 劉 贊 葉海林 符竣惠 徐啟綱 曾其強(qiáng) 吳建波 張啟瑜*(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，溫州 35000)

2(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，溫州 325000)

引言

以往的研究表明，同種甚至異種的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)可對(duì)成體細(xì)胞的生長(zhǎng)及干細(xì)胞的分化起重要作用［1］。不僅僅局限在皮膚［2］、膀胱［3］、心血管瓣膜［4］等組織，在組織工程應(yīng)用中，以ECM 來(lái)源的去細(xì)胞化支架，于體外重建體積較大、較復(fù)雜的器官組織如肺［5］、心臟［6］等也已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)，但仍有如回填細(xì)胞來(lái)源缺乏，器官功能重建不完善等諸多問(wèn)題［7］。其中之一就是細(xì)胞組分殘留與ECM 組分保護(hù)的矛盾問(wèn)題。各類去細(xì)胞化技術(shù)在去除細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)ECM 成分和結(jié)構(gòu)有著不同程度的損害，但在目前一些已經(jīng)臨床應(yīng)用的去細(xì)胞化支架中，存在很多因去細(xì)胞不完全而讓患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫排斥及細(xì)胞毒性反應(yīng)的事例。因此，建立一個(gè)完善的去細(xì)胞化效果評(píng)價(jià)體系十分重要［8-10］。在肝臟組織工程研究中，我們結(jié)合國(guó)內(nèi)外各種去細(xì)胞化方法，以大鼠肝臟為研究對(duì)象，采用一種新的全肝臟去細(xì)胞化流程來(lái)制作去細(xì)胞化支架，并檢測(cè)其形態(tài)結(jié)構(gòu)，ECM 各組分含量，供體細(xì)胞組分殘留量，完善評(píng)價(jià)其去細(xì)胞化效果。通過(guò)三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)與支架的結(jié)合，探討一種去細(xì)胞化支架在干細(xì)胞培養(yǎng)及肝臟疾病治療中的新的應(yīng)用模式。

1 材料與方法

1.1 材料

成年Sprague Dawley 大鼠(體重250 ～350 g;中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);去細(xì)胞化試劑有胰蛋白酶(Gibco 公司，中國(guó))、TritonX-100(Sigma 公司，中國(guó))、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA;Sigma 公司，中國(guó))、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS;Sigma 公司，中國(guó))、苯甲基磺酰(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF;Sigma 公司，中國(guó))、過(guò)氧乙酸(上?；瘜W(xué)試劑廠，中國(guó))、乙醇(上?；瘜W(xué)試劑廠，中國(guó))、青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco 公司，美國(guó))、兩性霉素B(Sigma 公司，美國(guó))、兔抗大鼠層粘連蛋白抗體(Bioworld 公司，美國(guó))、兔抗大鼠I 型膠原蛋白抗體(Bioworld 公司，美國(guó))、兔抗大鼠纖粘連蛋白抗體(Bioworld 公司，美國(guó))、氨基聚糖檢測(cè)試劑盒(Biocolor 公司，英國(guó))、大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(hepatocyte growth factor，HGF;enzyme linked immunosorbent assay，ELISA;R＆D 公司，美國(guó))、大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(vascular endothelial growth factor，VEGF;R＆D 公司，美國(guó))、組織酸水解法羥脯氨酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))、組織DNA 抽提試劑盒(QIAGEN 公司，美國(guó))、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 抗 體 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH;Bioworld 公司，美國(guó))、兔抗大鼠高遷移率族蛋白1 抗體(high mobility group，box-1 protein，HMGB1;Santa cruz 公司，美國(guó))、鼠抗鼠主要組織相容性復(fù)合體I 抗體(major histocompatibility complex I，MHC-I;Cell Signaling 公司，美國(guó));細(xì)胞培養(yǎng)材料有DMEM(Gibco 公司，中國(guó))、胎牛血清(Gibco 公司，古巴)，丁酸鈉(Sigma 公司，美國(guó));山羊抗大鼠白蛋白抗體(Santa Cruz 公司，美國(guó))。

所有關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作，均在溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 新型大鼠全肝臟去細(xì)胞化支架的制作

成年雄性SD 大鼠取腹部正中十字切口，暴露出肝下下腔靜脈和門脈系統(tǒng)區(qū)域并全身肝素化(肝素100 U/mL，1 ～2 mL)，標(biāo)記腹腔干，結(jié)扎膽總管。切開(kāi)膈肌，切斷食管、肝上及肝下下腔靜脈，門靜脈置8F 塑料管并雙重結(jié)扎固定，完整取下肝臟浸沒(méi)于0.1 mM PBS 液內(nèi)放置于-80℃下24 h 后室溫下解凍(物理法)。0.02% 胰酶/0.05% EDTA 溶液37℃下流速8 mL/min 灌洗肝臟2 h(酶學(xué)法)，后以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗15 min 洗去殘留胰酶。3% Triton-X100/0.05% EDTA/0.1% PMSF溶液灌洗肝臟16 ～18 h，以0.1% SDS 溶液再灌洗肝臟1 h(化學(xué)離子去污劑法)。此后以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗肝臟15 min，重復(fù)一次，接著再以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗30 min(高低滲溶液法)洗去殘留的化學(xué)去污劑。0.01%過(guò)氧乙酸/4%乙醇溶液灌洗肝臟1 h(消毒及去除殘留DNA)，再以青霉素/鏈霉素/兩性霉素B 溶液灌洗肝臟24 h 以上。以上過(guò)程中流速均為室溫下8 mL/min，嚴(yán)格注意無(wú)菌操作。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)分析

1.2.2.1 大體組織形態(tài)學(xué)

分別觀察不同去細(xì)胞階段肝臟的大體形態(tài)，支架浸泡于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后H＆E 染色，光鏡下觀察組織的結(jié)構(gòu)，并與正常肝臟組織進(jìn)行對(duì)比。

1.2.2.2 Ⅰ型膠原、層粘連蛋白、纖粘連蛋白的分布

去細(xì)胞支架及新鮮正常肝臟組織4%多聚甲醛固定，包埋切片，3% 牛血清蛋白封閉后，分批加入1:200 稀釋的兔抗大鼠層粘連蛋白抗體、兔抗大鼠I型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠纖粘連蛋白抗體室溫孵育2 h，滴加生物素化二抗(山羊抗兔)室溫孵育20 min，再滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，0.1 mM PBS 沖洗后加入DAB 顯色，光鏡下觀察I 型膠原蛋白、纖粘連蛋白及層粘連蛋白的分布及含量。

1.2.2.3 掃描電鏡檢測(cè)

去細(xì)胞化支架及正常肝臟組織經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定，梯度酒精逐級(jí)脫水，置換，臨界點(diǎn)干燥后噴金，掃描電鏡觀察組織內(nèi)的血管及各種細(xì)微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 細(xì)胞外基質(zhì)成分含量檢測(cè)

1.2.3.1 氨基聚糖的檢測(cè)

采用氨基聚糖含量檢測(cè)試劑盒。分別稱取50～100 mg 新鮮肝臟組織和去細(xì)胞化支架，65℃木瓜蛋白酶消化3 h，設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本，分別加入GAG 染料，常溫震蕩30 min 后12 000 r/min 離心10 min。干燥后加入解離劑，10 min 后酶標(biāo)儀656 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線及組織內(nèi)GAG 的含量。

1.2.3.2 總膠原蛋白檢測(cè)

組織酸水解法羥脯氨酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)。準(zhǔn)確稱取25 ～50 mg 新鮮正常肝臟組織及去細(xì)胞化支架，加6 mol/L HCL 沸水浴水解5 h 后調(diào)pH 至6.0～6.8，離心取上清后，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，分別按順序加入試劑1、試劑2、試劑3，60℃水浴15 min 后離心，上清于550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。羥脯氨酸含量的計(jì)算公式為:

組織總膠原蛋白含量按羥脯氨酸的含量占總膠原蛋白含量的14%來(lái)估算。

1.2.3.3 細(xì)胞因子HGF 及VEGF 含量的檢測(cè)

大鼠HGF ELISA 試劑盒、大鼠VEGF ELISA 試劑盒檢測(cè)。分別稱取25 ～50 mg 新鮮肝臟組織和去細(xì)胞化支架，勻漿取上清，設(shè)置好空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品組，按順序加入抗IGFBP-3 抗體、鏈霉親和素-HRP，37℃溫育60 min 后，洗板，加入顯色劑A、B，37℃避光孵育10 min 后加終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線及對(duì)應(yīng)的組織內(nèi)HGF 和VEGF 含量。

1.2.4 細(xì)胞組分殘留檢測(cè)

為正確評(píng)價(jià)新型去細(xì)胞化流程(n =5)在去除細(xì)胞殘留組分的效果，將其設(shè)為A 組，在與正常肝臟組織(n =5)C 組比較的同時(shí)，參照文獻(xiàn)［7］法制作的支架(n =8)作為B 組進(jìn)行對(duì)比，觀察以下組分含量的大小。

1.2.4.1 DNA 殘留量檢測(cè)

組織DNA 抽提試劑盒檢測(cè)。分別稱取25 ～50 mg 的A、B、C 組組織，蛋白酶k 在55℃下消化組織3 h，具體步驟按試劑盒內(nèi)說(shuō)明書要求操作，以酶標(biāo)儀260 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)抽提出樣本的DNA 吸光度值，組織DNA 的含量(μg/mg)按5 倍的吸光度值計(jì)算。

1.2.4.2 GAPDH、MHC-I 及HMGB1 蛋白殘留量的檢測(cè)

采用 Western-blotting 法，分別稱取25 ～50 mgA、B、C 組組織勻漿，提總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。為了比較單位組織內(nèi)各組間蛋白殘留量的差別，每孔統(tǒng)一稀釋至20 μg 組織所含蛋白后上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，孵一、二抗，曝光。Quantity One 軟件分析灰度值比較各蛋白殘留量大小。

1.2.5 與三維培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合誘導(dǎo)培養(yǎng)WBF-344細(xì)胞

去細(xì)胞后的支架連入自行設(shè)計(jì)組裝的三維雙腔循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，以分時(shí)多次法注入數(shù)目為107的WBF-344 卵圓細(xì)胞，含10% 胎牛血清及3.75 mmol/mL 丁酸鈉的DMEM 培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，H＆E染色及白蛋白免疫熒光觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

測(cè)量結(jié)果通過(guò)SPSS15.0 軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student t 檢驗(yàn)判斷兩個(gè)樣本均數(shù)之間有無(wú)差別，細(xì)胞組分殘留量的比較采用多樣本方差分析法，P ＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)(1 － 儲(chǔ)液氧合腔;2 － 支架灌流腔;3 －蠕動(dòng)泵;4 －去氣泡裝置;5 －鼓泡式氧合口)Fig．1 Three dimensional perfusion culture system (1 －Reservoirs;2 － Perfusion chamber;3 － Peristaltic pump;4 － Bubble trapper;5 － Bubble oxygenator)

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 大體組織學(xué)觀察

整個(gè)去細(xì)胞化過(guò)程共用時(shí)72 h，期間肝臟逐漸變白并透明化，內(nèi)部可見(jiàn)管脈系統(tǒng)完整。H＆E 染色結(jié)果顯示去細(xì)胞化后未見(jiàn)明顯供體細(xì)胞成分及DNA 殘留，血管網(wǎng)系統(tǒng)尚完整(見(jiàn)圖2)。

圖2 大體組織學(xué)觀察。(a)正常肝臟;(b)去細(xì)胞化完成后肝臟;(c)正常肝臟組織H＆E 染色(200 ×);(d)去細(xì)胞化支架H＆E 染色(200×，* :門靜脈)Fig． 2 Morphological and histological observation． (a ) Normal liver; (b )Decellularized liver;(c)Hematoxylin and eosin staining of normal liver (200 × );(d )Hematoxylin and eosin staining of decellularized liver (200 ×，* :the portal vein)

2.1.2 I 型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白的分布

樣本經(jīng)免疫組化染色后，與正常組織比較，去細(xì)胞化支架內(nèi)仍保留有大量的I 型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)主要成分(見(jiàn)圖3)。

2.1.3 掃描電鏡檢測(cè)

掃描電鏡觀察顯示，在去除細(xì)胞后，未見(jiàn)明顯細(xì)胞殘留成分，細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)保持完好，三維結(jié)構(gòu)未遭破壞(見(jiàn)圖4)。

2.2 細(xì)胞外基質(zhì)成分含量檢測(cè)

2.2.1 氨基聚糖的檢測(cè)兩兩比較

對(duì)組織中GAG 含量的檢測(cè)結(jié)果顯示:正常組織的含量(79.88 ±3.48)μg/g，去細(xì)胞化支架組織的含量為(71.06 ±1.92)μg/g。與正常組織比較，P ＜0.05，在去細(xì)胞化后，GAG 有一定的損失(見(jiàn)圖5)。

2.2.2 總膠原蛋白含量檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)羥脯氨酸的含量，估算出總膠原蛋白含量為:正常組織(83.76 ± 6.37)μg/g，去細(xì)胞支架(87.45 ±4.46)μg/g。兩組數(shù)據(jù)比較，P ＞0.05，說(shuō)明去細(xì)胞化過(guò)程未對(duì)總膠原蛋白含量有影響(見(jiàn)圖6)。

圖3 免疫組化結(jié)果(400 ×)。(a)正常肝臟組織I 型膠原蛋白;(b)去細(xì)胞化支架I 型膠原蛋白;(c)正常肝臟組織層粘連蛋白;(d)去細(xì)胞化支架層粘連蛋白;(e)正常肝臟組織纖粘連蛋白;(f)去細(xì)胞化支架纖粘連蛋白Fig． 3 The results of immunohistochemistry． (400 × )(a)Collagen I of normal liver;(b)Collagen I of decellularized liver;(c)Laminin of normal liver;(d)Laminin of decellularized liver;(e)Fibronectin of normal liver;(f)Fibronectin of decellularized liver

2.2.3 細(xì)胞因子HGF 及VEGF 含量的檢測(cè)

ELISA 法檢測(cè)結(jié)果為:正常組織含HGF (44.46±4.64)ng/g，VEGF (34.78 ±3.23)ng/g;去細(xì)胞化支架含HGF (19.68 ±1.49)ng/g，VEGF (13.44 ±1.94)ng/g。P ＜0.05，去細(xì)胞化支架內(nèi)仍保留有一定量的細(xì)胞因子HGF 和VEGF(見(jiàn)圖7)。

2.3 細(xì)胞組分殘留檢測(cè)

2.3.1 DNA 殘留量檢測(cè)

各組DNA 含量分別為A 組(新型去細(xì)胞化流程組):(0.66 ±0.15)μg/g;B 組(文獻(xiàn)［7］法組):(0.90 ±0.21)μg/g;C 組(正常組織組):(17.73 ±2.20)μg/g。與正常肝臟組織C 組比較，P ＜0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明A、B 兩組去細(xì)胞方法均能達(dá)到目前公認(rèn)對(duì)去細(xì)胞支架DNA 含量的要求。A、B 兩組間比較，P ＞0.05，差別不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)A、B 兩組去細(xì)胞化過(guò)程中對(duì)DNA 的去除效果相當(dāng)(見(jiàn)圖8)。

2.3.2 GAPDH、MHC-I 及HMGB1 蛋白殘留量的檢測(cè)

Quantity One 軟件分析灰度值后各蛋白殘留量如圖9 所示，與C 組比較，P ＜0.05，A、B 兩組中GAPDH、MCH-I、HMGB-1 的殘留量都有所下降。同樣，A、B 兩組比較，P ＜0.05，表明相較B 組的去細(xì)胞流程，A 組能更完全的去除殘留的細(xì)胞組分。

2.4 三維培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合培養(yǎng)WBF －344 細(xì)胞

WBF-344 卵圓細(xì)胞注入培養(yǎng)系統(tǒng)后的第3 d 及第7 d，H＆E 染色和白蛋白免疫熒光顯示(見(jiàn)圖10)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，能較好的貼附于支架上，白蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。

3 討論和結(jié)論

近些年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)于使用酶學(xué)法、物理法、化學(xué)試劑、滲透壓法等不同去細(xì)胞方法處理不同組織過(guò)程的深入研究，證明了不同的去細(xì)胞化方法，以不同的流程組合處理同樣的組織其效果不盡相同。學(xué)界公認(rèn)以DNA 殘留量為去細(xì)胞化是否成功的最低要求，一般支架內(nèi)DNA 含量應(yīng)小于5 μg/g的上限，并且H＆E 染色觀察無(wú)明顯DNA 成分殘留，才能稱為完成去細(xì)胞化［11］。

圖4 掃描電鏡(1200 ×)。(a)正常肝臟組織;(b)去細(xì)胞化支架Fig． 4 The results of scanning electron microscope(1200 × )． (a)Normal liver;(b)Decellularized liver

圖5 GAG 含量Fig．5 GAG content

圖6 總膠原含量Fig．6 Total collagen content

圖7 ELISA 結(jié)果。(a)HGF 含量;(b)VEGF 含量Fig． 7 ELISA results． (a)HGF content;(b)VEGF content

肝臟作為一個(gè)體積較厚、含有大量細(xì)胞成分的復(fù)雜器官，其去細(xì)胞化一直是研究熱點(diǎn)。Uygun 等最早應(yīng)用不同濃度梯度的SDS 經(jīng)血管灌洗，成功去除了肝臟細(xì)胞獲得了大鼠全肝臟支架，并進(jìn)行了原代肝臟細(xì)胞回填培養(yǎng)，但去細(xì)胞化用時(shí)較長(zhǎng)，達(dá)5 d，且SDS 做為一種離子型去污劑有著較好的去細(xì)胞化效果的同時(shí)，對(duì)ECM 結(jié)構(gòu)的破壞也相當(dāng)大，其中GAG 的丟失達(dá)50%以上［12］。國(guó)內(nèi)胡鵬蘊(yùn)等也同樣進(jìn)行了以不同濃度SDS 處理為主的去細(xì)胞化支架制作，但未對(duì)支架做完善的評(píng)價(jià)［13］。此后Soto-Gutierrez 等提出了以濃度3%的TritonX-100 為主要方法的去細(xì)胞流程，結(jié)果表明TritonX-100 作為一種較溫和的非離子型去污劑在達(dá)到與SDS 相近的去細(xì)胞效果同時(shí)，也相應(yīng)的減少了對(duì)ECM 的破壞，通過(guò)酶學(xué)、滲透壓等多種方法的合理結(jié)合，時(shí)間上更是大大縮短至3 d［14］，Baptista 等在以tritonX-100 為主的肝臟去細(xì)胞化處理后，其支架所含GAG 相比正常組幾乎沒(méi)有損失［15］。深入研究證明，對(duì)于去細(xì)胞化殘留物的評(píng)價(jià)上，單一的DNA 殘留量還是不夠的。B?er 等研究了規(guī)范化流程對(duì)馬頸動(dòng)脈的去細(xì)胞化過(guò)程，在DNA 殘留量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后，仍有大量的細(xì)胞殘留成分，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器碎片等［8］。另外Keane 等對(duì)目前很多常見(jiàn)的臨床去細(xì)胞化支架產(chǎn)品的研究表明，很多產(chǎn)品由于未去除殘留細(xì)胞組分而導(dǎo)致嚴(yán)重的巨噬細(xì)胞吞噬反應(yīng)［10］。因此，一個(gè)完善的去細(xì)胞化效果評(píng)價(jià)是此類技術(shù)能否成功應(yīng)用于臨床實(shí)踐的關(guān)鍵。

圖8 DNA 含量Fig．8 DNA content

圖9 細(xì)胞組分殘留量。(a)WB 條帶;(b)GAPDH含量;(c)MCH-I 含量;(d)HMGB-1 含量Fig．9 The residual content of cell components． (a)WB band pattern;(b)GAPDH content;(c)MCH-I content;(d)HMGB-1 content

本研究在去細(xì)胞化流程設(shè)計(jì)上，通過(guò)結(jié)合與改進(jìn)Uygun 等及Soto-Gutierrez 等兩種不同的大鼠全肝臟去細(xì)胞化流程，以溫和的非離子型去污劑TritonX-100 為主要方法，減少對(duì)ECM 的破壞。在去細(xì)胞過(guò)程前期加入蛋白酶抑制劑PMSF，減少蛋白的降解;在后期輔助以去細(xì)胞能力較強(qiáng)的離子型去污劑SDS，以求能完全去除細(xì)胞殘留成分。SDS 的濃度控制在0.1%，既能較好的發(fā)揮其解離洗脫蛋白的作用，也不會(huì)對(duì)ECM 造成嚴(yán)重破壞。評(píng)價(jià)體系上我們從細(xì)胞外基質(zhì)組分和供體細(xì)胞組分殘留兩個(gè)角度入手，結(jié)果顯示:與正常組織比較，新型去細(xì)胞化流程制作出來(lái)的支架內(nèi)滿足DNA 殘留量的要求，保留了血管網(wǎng)等三維支架組織，膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白等ECM 主要成分在支架內(nèi)豐富存在，它們與部分保存住了的細(xì)胞因子HGF 和VEGF 一起能更好的模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和干細(xì)胞的分化。結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，Soto-Gutierrez 等的流程在達(dá)到DNA 殘留量的標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，仍有部分細(xì)胞組分如GAPDH、HMGB-1、MCH-I 殘留。GAPDH 作為細(xì)胞內(nèi)部恒量表達(dá)的蛋白，其殘留量對(duì)細(xì)胞骨架蛋白總殘留有著很好的代表性。HMGB -1 作為細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)，其存在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有著很大的影響［16］。而MCH-I 作為免疫排斥反應(yīng)的主要激動(dòng)蛋白，為了滿足移植的需求，同樣不應(yīng)在支架內(nèi)殘留。本研究開(kāi)發(fā)出的新型去細(xì)胞化流程雖然可能在加入SDS 后導(dǎo)致GAG 含量上減少了20%左右，但幾乎完全消除了以上供體細(xì)胞殘留的蛋白，在保護(hù)基質(zhì)與去除細(xì)胞殘留物的矛盾中尋找到了平衡點(diǎn)，評(píng)價(jià)體系較之此前的工作更加完善與科學(xué)。

圖10 WBF-344 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果。(a)和(b):培養(yǎng)第3 d 和第7 d 細(xì)胞H＆E 染色(400 ×);(c)和(d):培養(yǎng)第3 d 和第7 d 細(xì)胞白蛋白免疫熒光檢測(cè)(800 ×)Fig．10 WBF-344 cells induced culture results．(a)＆(b):H＆E staining in day 3 and day 7(400 ×);(c)＆(d):The immunofluorescence of albumin in day 3 and day 7(800 ×)

此外，本研究中設(shè)計(jì)的三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)的特點(diǎn)是生物反應(yīng)器與去細(xì)胞支架結(jié)合，提出“雙腔”培養(yǎng)概念。內(nèi)腔容積小，用于盛放支架及制造灌流循環(huán);外腔容積大，用于氧合、酸堿度維持及養(yǎng)分供給。此概念將傳統(tǒng)意義上的儲(chǔ)液池和生物反應(yīng)器結(jié)合在一起，以內(nèi)腔壁上的細(xì)胞篩網(wǎng)口相通，防止內(nèi)腔游離的細(xì)胞流向外腔，從而提高了內(nèi)腔循環(huán)的細(xì)胞密度，利于細(xì)胞盡快貼附于支架上支架內(nèi)。誘導(dǎo)培養(yǎng)WBF -344 卵圓細(xì)胞的結(jié)果，在進(jìn)一步證明本研究中去細(xì)胞化流程制作出來(lái)的支架功能良好的同時(shí)，也說(shuō)明了在體外通過(guò)類似體內(nèi)環(huán)境的三維ECM 培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分化擴(kuò)增、大量獲得功能良好的肝細(xì)胞是可能的。

總之，外科手術(shù)移植目前仍是治療終末期肝病比如門脈高壓性肝硬化等的最常用手段，但肝源缺乏和免疫排斥反應(yīng)仍然是制約肝移植發(fā)展的主要因素。通過(guò)對(duì)供體器官進(jìn)行去細(xì)胞化而得到的天然ECM 支架，以患者自體干細(xì)胞為種子細(xì)胞進(jìn)行重填培養(yǎng)并使之分化為目的細(xì)胞的技術(shù)，可以作為肝移植之外治療終末期肝病的新選擇之一，有著廣闊的應(yīng)用前景。整個(gè)系統(tǒng)可與人工肝臟的概念結(jié)合，用于等待肝臟或者肝細(xì)胞移植患者的全身白蛋白的增加及替代病肝的解毒作用緩解門靜脈壓力等，并可培養(yǎng)患者用于自體移植的肝臟細(xì)胞。最終隨著其他相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，于體外形成新的器官，移植回病人體內(nèi)，以此來(lái)替代異體器官移植達(dá)到最終治療的目的。

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