王育華，王玉潯，安雅臣，紀(jì)春梅，劉國(guó)榮，趙曉晶，高素玲，張江，王艷，馮福民

HLA-DRB1基因多態(tài)性與糖尿病并發(fā)肺結(jié)核易感性的研究①

王育華1，王玉潯2，安雅臣2，紀(jì)春梅3，劉國(guó)榮2，趙曉晶2，高素玲2，張江2，王艷2，馮福民2

目的探討HLA-DRB1基因多態(tài)性與我國(guó)北方漢族糖尿病并發(fā)肺結(jié)核易感性的關(guān)系。方法采用1∶1配對(duì)的病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，以我國(guó)北方漢族124例糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，以與病例同民族、同性別、年齡相差不超過(guò)3歲，相同居住地(城市或農(nóng)村)，且經(jīng)統(tǒng)一結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)確認(rèn)為有結(jié)核分支桿菌感染的2型糖尿病患者為對(duì)照組；采用聚合酶鏈反應(yīng)-特異性序列引物(PCR-SSP)的方法檢測(cè)HLA-DRB1基因DR15、DR16、DR1、DR11位點(diǎn)多態(tài)性，對(duì)與肺結(jié)核相關(guān)的危險(xiǎn)因素進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行單因素和多因素條件Logistic回歸分析。結(jié)果在病例組中，攜帶DR15基因突變型患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增高(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002)；DR15位點(diǎn)突變與DR16位點(diǎn)突變同時(shí)存在時(shí)風(fēng)險(xiǎn)更大(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476)。對(duì)17個(gè)環(huán)境危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素分析，在多因素分析中調(diào)整卡痕、體質(zhì)量指數(shù)、家族史3個(gè)因素后，DR15突變基因型仍與糖尿病并發(fā)肺結(jié)核顯著相關(guān)(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。結(jié)論HLA-DR15基因突變型可能為2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核的易感基因型。

結(jié)核；肺；糖尿?。籋LA基因；基因多態(tài)性；病例對(duì)照研究

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 病例組 2010年3月～2012年6月在唐山市結(jié)核病醫(yī)院連續(xù)確診的2型糖尿病并發(fā)初治繼發(fā)型肺結(jié)核患者，糖尿病和肺結(jié)核的診斷明確，糖尿病病程在1年以上，且確診時(shí)間早于肺結(jié)核1年以上，并排除肺炎、肺癌、塵肺、長(zhǎng)期使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑、HIV感染等免疫功能低下可能影響易感性的患者。

1.1.2 對(duì)照組 對(duì)照組來(lái)自河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院同期住院的2型糖尿病患者，且要求與病例同民族、同性別、年齡相差不超過(guò)3歲，相同居住地(城市或農(nóng)村)，且經(jīng)統(tǒng)一結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)確認(rèn)為有結(jié)核分支桿菌感染的2型糖尿病患者(有卡痕者PPD硬結(jié)反應(yīng)平均直徑≥10 mm[4-5]，無(wú)卡痕、無(wú)卡介苗接種史者PPD硬結(jié)反應(yīng)平均直徑5～10 mm)，且排除：①與研究對(duì)象有血緣關(guān)系；②現(xiàn)在或既往有結(jié)核病史。本研究采用1∶1匹配的方法，嚴(yán)格按照對(duì)照組納入排除標(biāo)準(zhǔn)選擇2型糖尿病患者為對(duì)照組，且保證與每例病例匹配的對(duì)照至少有2例，在其中隨機(jī)選取1例與病例結(jié)為對(duì)子。另外咳嗽2周以上或經(jīng)胸部X線檢查有可疑肺結(jié)核病變者也予以排除。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查 設(shè)計(jì)統(tǒng)一的專(zhuān)用調(diào)查表，經(jīng)過(guò)預(yù)調(diào)查及反復(fù)修訂后正式應(yīng)用。采用面對(duì)面問(wèn)卷調(diào)查形式，由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查人員逐一詢(xún)問(wèn)調(diào)查表內(nèi)容并認(rèn)真填寫(xiě)，內(nèi)容包括研究對(duì)象出生年月、職業(yè)、文化程度、民族、婚姻狀況、呼吸系統(tǒng)疾病史及其他重大疾病史、煙酒嗜好、衛(wèi)生習(xí)慣、飲食生活習(xí)慣、家庭經(jīng)濟(jì)狀況、住房狀況、家族患結(jié)核病情況、結(jié)核病接觸史、卡介苗接種史及其他系統(tǒng)疾病史和服藥史。

1.2.2 PPD試驗(yàn)篩選 所有入選人員均采用孟都氏(Mantous)法[4]行PPD實(shí)驗(yàn)檢查。

1.2.3 基因組DNA的獲取 每個(gè)研究對(duì)象晨起空腹抽取靜脈血5 ml，2%EDTA 0.5 ml抗凝，冰盒保存。采用低滲溶血法分離白細(xì)胞，常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。

1.2.4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段 引物設(shè)計(jì)參照參考文獻(xiàn)[5]，反復(fù)核實(shí)堿基序列，委托大連寶生物公司合成引物，同時(shí)合成NRAMP1-Exon8作為陽(yáng)性?xún)?nèi)參照物，如表1。PCR擴(kuò)增體系：25 μl體系，其中1U Taq DNA聚合酶，2.5 μl 10×PCR Buffer，5.0 μl dNTPs，上下游引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，滅菌雙蒸水14.5 μl。循環(huán)體系：94℃預(yù)變性60 s，94℃變性60 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性15 s，60℃復(fù)性25 s，72℃延伸20 s，終末延伸72℃300 s，28個(gè)循環(huán)。以DR15位點(diǎn)為例，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量，樣品在紫外燈下觀察(234 bp為內(nèi)參)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用EXCEL 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平α=0.05。采用條件Logistic回歸模型進(jìn)行單因素分析和多因素逐步回歸分析。計(jì)算各因素的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)，來(lái)估計(jì)相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)。顯著性檢驗(yàn)采用最大似然比檢驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

在連續(xù)收治的124例漢族成人糖尿病并發(fā)肺結(jié)核住院患者中，男性83例(66.9%)，女性41例(33.1%)，兩者比例約為2∶1；來(lái)源于農(nóng)村的患者75例(60.5%)，來(lái)源于城市的患者49例(39.5%)，兩者比例約為3∶2。男性患者平均年齡(47.0±15.8)歲，女性平均年齡(37.4±14.7)歲。按照對(duì)照組配對(duì)條件最后隨機(jī)抽出124例糖尿病患者作為對(duì)照組，其中男性平均年齡(44.9±15.2)歲，女性(42.3±12.1)歲，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)(t＝0.843和1.671，P＞0.05)與病例組年齡無(wú)顯著性差異。

2.2 有關(guān)因素的條件Logistic回歸分析

研究因素的賦值方式見(jiàn)表1。

2.2.1 單因素分析 經(jīng)單因素條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，與糖尿病并發(fā)肺結(jié)核發(fā)病有聯(lián)系的因素有：體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、卡介苗接種史、卡痕、結(jié)核病接觸史和結(jié)核病家族史。BMI≤20、無(wú)卡介苗接種史、無(wú)卡痕、接觸史、結(jié)核病家族史等因素會(huì)增加肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)性；而B(niǎo)MI高則能減少肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)性。DR15基因型肺結(jié)核發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)亦增高，故DR15基因突變型可能是糖尿病并發(fā)肺結(jié)核發(fā)病易感基因型。見(jiàn)表2。

2.2.2 多因素分析 為排除各研究因素之間的相互干擾作用，控制混雜因素的影響，我們將單因素分析中有顯著意義的變量作為協(xié)變量，同時(shí)分別引入研究對(duì)象的基因型，以糖尿病患者肺結(jié)核是否發(fā)病為因變量，進(jìn)行多因素條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示調(diào)整卡痕、家族史、BMI后，DR15突變基因型仍與肺結(jié)核發(fā)病顯著相關(guān)(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945)。見(jiàn)表3。

2.2.3 基因位點(diǎn)聯(lián)合作用分析 為分析各基因位點(diǎn)多態(tài)性之間的聯(lián)合作用，對(duì)各基因型多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行叉生分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DR15位點(diǎn)突變的情況下，如果存在DR16位點(diǎn)突變，則肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更大。見(jiàn)表4。

表1 Logistic回歸模型中各因素的賦值方式

表2 單因素條件Logistic回歸分析

表3 肺結(jié)核病發(fā)病影響因素的多因素條件Logistic回歸分析

表4 HLA-DRB1基因多態(tài)位點(diǎn)在兩組中的聯(lián)合分析

3 討論

當(dāng)前普遍認(rèn)為，糖尿病患者體內(nèi)胰島素分泌不足，導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂，造成營(yíng)養(yǎng)不良，有利于結(jié)核桿菌的入侵和發(fā)展；同時(shí)因?yàn)樘悄虿』颊哐獌?nèi)糖量增多，脂肪代謝異常，甘油產(chǎn)物蓄積，代謝性酸性環(huán)境均有助于結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)生殖[6]，致使并發(fā)結(jié)核病的機(jī)率增加。糖尿病由于糖代謝紊亂，導(dǎo)致糖原異生作用加強(qiáng)，蛋白分解加速以致抗體補(bǔ)體和免疫球蛋白生成減少，致使機(jī)體抗體水平減低和免疫力下降，降低機(jī)體防御功能。另外，糖尿病患者維生素A缺乏，使呼吸道黏膜上皮對(duì)外界感染抵抗力下降，易被結(jié)核桿菌感染。

大量遺傳學(xué)證據(jù)表明，肺結(jié)核的發(fā)生是環(huán)境因素與機(jī)體遺傳因素共同作用的復(fù)雜結(jié)果?，F(xiàn)代結(jié)核病的研究和進(jìn)展已經(jīng)證明，個(gè)體對(duì)結(jié)核病易感性的差異部分是由宿主基因決定的。肺結(jié)核與細(xì)胞免疫密切相關(guān)。現(xiàn)代免疫學(xué)證實(shí)，T細(xì)胞受體-抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體構(gòu)成的三分子復(fù)合體是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子基礎(chǔ)。因此，HLA與肺結(jié)核的相關(guān)性研究成為目前結(jié)核病研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

目前對(duì)于HLA基因與肺結(jié)核相關(guān)聯(lián)的確切發(fā)生機(jī)理尚不完全清楚，普遍認(rèn)為入侵的結(jié)核菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)得以繁殖生長(zhǎng)，其抗原經(jīng)由溶菌酶的處理或因巨噬細(xì)胞死亡而釋出，通過(guò)HLA-Ⅱ類(lèi)分子進(jìn)行抗原呈遞給輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+)表面特殊的淋巴細(xì)胞受體，使之致敏，并繁殖形成單克隆細(xì)胞系。當(dāng)再次受抗原攻擊時(shí)，淋巴細(xì)胞便產(chǎn)生多種淋巴因子，包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞趨化因子(CF)、巨噬細(xì)胞激活因子特別是干擾素-γ(INF-γ)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和-β(TNF-α和TNF-β)，以及移動(dòng)抑制因子(MIF)、有絲分裂因子(MF)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子(LTF)等，從而導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化、留駐局部、激活、分裂繁殖以及未致敏直接轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)在CD4+細(xì)胞介導(dǎo)抗結(jié)核免疫反應(yīng)過(guò)程中，抑制性T淋巴細(xì)胞(CD8+)也參與作用。這種作用通過(guò)HLA-Ⅰ類(lèi)分子遞呈。它溶解已吞噬結(jié)核菌和受抗原作用的巨噬細(xì)胞，使結(jié)核菌釋放和擴(kuò)散；它亦使宿主細(xì)胞溶解，造成組織破壞。另一方面，藏匿在宿主某些細(xì)胞中不能被殺滅的結(jié)核菌借助CD8+細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的溶解作用而釋放，進(jìn)而為鄰近部位具有高度殺菌活力的巨噬細(xì)胞吞噬和消滅[7-8]。

本研究顯示：①HLA-DR15基因突變型可能是肺結(jié)核發(fā)病易感基因型；②DR15位點(diǎn)突變?nèi)绻cDR16位點(diǎn)突變同時(shí)存在時(shí)，兩基因聯(lián)合作用可能具有協(xié)同作用，能顯著增加結(jié)核病的易感性；③卡痕、BMI、結(jié)核病家族史可能是肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素。這與朱紅[3]等研究的結(jié)果不同，這可能與研究目標(biāo)人群及對(duì)照組的選擇有關(guān)。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和后基因組時(shí)代的到來(lái)，越來(lái)越多的結(jié)核易感基因，如VDR(vitamin D receptor)基因、MBL(mannose binding lectin)基因和HLA (human leukocyte antigen)基因等被發(fā)現(xiàn)，而基因組流行病學(xué)研究的開(kāi)展將使這些易感基因在不同人群中的分布、它們對(duì)疾病發(fā)生所起的作用及基因與基因間和基因與環(huán)境間的交互作用被逐步闡明。這有助于肺結(jié)核高危人群的預(yù)測(cè)，為優(yōu)選干預(yù)措施(醫(yī)學(xué)干預(yù)、行為干預(yù)或環(huán)境干預(yù))提供科學(xué)依據(jù)。

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Relationship between HLA-DRB1 Gene Polymorphisms and Susceptibility of Pulmonary Tuberculosis in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus:124 Case-control Study

WANG Yu-hua,WANG Yu-xun,AN Ya-chen,et al.Department of Neurology,Affiliated Hospital,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei,China

ObjectiveTo investigate the association between the HLA-DRB1 gene polymorphisms and susceptibility of pulmonary tuberculosis(TB)in patients with type 2 diabetes mellitus in North China.MethodsA 1∶1 matched case-control study was adopted.Polymerase chain reaction-sequence-specific primers techniques(PCR-SSP)and restriction fragment length polymorphism(RFLP)was used to type polymorphisms(DR15,DR16,DR1,DR11).Information on environmental-related risk factors and pathological changes of tuberculosis was collected using a pre-tested standard questionnaire.Variance analysis,Chi-square,univariate and multivariate conditional Logistic analysis were conducted with SPSS 12.0 for Window.ResultsA sample of 124 pairs of cases and controls was studied.Univariate analysis demonstrated that DR15 mutant increased the risk of susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR＝2.461,95%CI:1.363～4.444,P=0.002), and it would further increased if DR16 mutant occurred together(OR=4.904,95%CI:1.554～15.476).In multivariate analysis,DR15 mutant also associated with susceptibility of pulmonary tuberculosis(OR=2.996,95%CI:1.51～5.945).ConclusionPolymorphism of DR15 genotype might be a susceptible genotype of TB patients with type 2 diabetes mellitus in North China.

tuberculosis;pulmonary;diabetes;HLAgene;polymorphism;case-control study

R587.1

A

1006-9771(2013)06-0561-04

河北聯(lián)合大學(xué)博碩科研基金(No.BS05010)。術(shù)，從遺傳學(xué)角度探討HLA基因多態(tài)性與我國(guó)北方漢族成年糖尿病患者并發(fā)肺結(jié)核的關(guān)系，為我國(guó)結(jié)核病防治提供新的思路。

2013-01-04

2013-03-20)

1.唐山市結(jié)核病醫(yī)院，河北唐山市063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山市063000；3.唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北唐山市063000。作者簡(jiǎn)介：王育華(1970-)，女，漢族，河北樂(lè)亭縣人，副主任醫(yī)師，主要研究方向：結(jié)核病內(nèi)科學(xué)。通訊作者：安雅臣。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.06.017

[本文著錄格式]王育華，王玉潯，安雅臣，等.HLA-DRB1基因多態(tài)性與糖尿病并發(fā)肺結(jié)核易感性的研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(6):561-564.

糖尿病是由不同原因引起的人體內(nèi)胰島素絕對(duì)不足或相對(duì)不足，以致糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝發(fā)生障礙，而引起以高血糖為共同特征的臨床綜合征。中國(guó)糖尿病患者總數(shù)超過(guò)歐洲和美國(guó)糖尿病患者的總和，到目前為止估計(jì)有3000萬(wàn)，居世界第二位[1]。由于糖尿病患病率增加、結(jié)核發(fā)病“回潮”(發(fā)達(dá)國(guó)家)和控制不良(發(fā)展中國(guó)家)，糖尿病并發(fā)結(jié)核病人數(shù)也逐年增多，糖尿病患者中肺結(jié)核的發(fā)生率是正常人的4～8倍[2]。而糖尿病又是肺結(jié)核重要的相關(guān)性疾病，糖尿病患者是結(jié)核病的易感者，而結(jié)核病又是誘發(fā)、加重糖尿病發(fā)生酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥的重要常見(jiàn)的原因之一[3]。因此，兩病的并發(fā)一直是臨床醫(yī)師所關(guān)注的重要課題。本研究采用1∶1配對(duì)病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，利用聚合酶鏈反應(yīng)-特異性引物序列(PCR-SSP)技