馮晨，馮華，溫宏麗，劉勁睿

塞來昔布對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251增殖及凋亡的影響①

馮晨1a，馮華1b，溫宏麗1c，劉勁睿2

目的探討非甾體類抗炎藥(NSAIDs)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響。方法選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251，分別加入0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的塞來昔布進行處理。四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測U251細胞增殖水平及抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果隨塞來昔布濃度的增加，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251增殖水平明顯降低，增值抑制率升高。不同濃度和不同作用時間，塞來昔布對U251細胞增殖抑制率有顯著性差異(P＜0.05)；流式細胞術(shù)細胞凋亡率檢測顯示，80 μmol/L塞來昔布處理48 h的U251細胞凋亡率(17.86%)較0 μmol/L(11.23%)增高(P＜0.05)。結(jié)論塞來昔布可抑制人膠質(zhì)瘤細胞U251的生長和增殖，促進U251的凋亡發(fā)生，以80 μmol/L為佳。

膠質(zhì)瘤；U251細胞；塞來昔布；增殖；凋亡

[本文著錄格式]馮晨，馮華，溫宏麗，等.塞來昔布對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251增殖及凋亡的影響[J].中國康復理論與實踐, 2013,19(6):532-535.

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，是高度血管化的血管生成依賴性生長的人類腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率和病死率均為最高，是嚴重威脅人類健康和生命的主要疾病之一[1-4]。近年來的研究表明，非甾體抗炎藥(non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)的應用與癌癥危險性的降低之間有著顯著相關(guān)性，NSAIDs這種抑制惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用主要與抑制環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase-2,Cox-2)的活性有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員在惡性腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。本研究檢測體外塞來昔布干預對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251增殖活性、凋亡發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251：哈爾濱醫(yī)科第四附屬醫(yī)院腦外科饋贈；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、聚氧乙烯醚類(Triton X)-100、青/鏈霉素、胰蛋白酶及塞來昔布：美國SIGMA公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)：美國Amresco公司。

1.2 標本的留取

人膠質(zhì)瘤細胞U251的傳代培養(yǎng)：①細胞培養(yǎng)2～3 d，細胞鋪滿單層后，在無菌操作臺上將舊培養(yǎng)液從培養(yǎng)瓶中倒出，吸取已高壓滅菌的PBS液2 ml清洗細胞，棄去，然后加入0.5%胰酶1 ml，于倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況；②約5 min，細胞開始固縮變圓，細胞間隙增大，見少許細胞漂浮起來，此時，迅速向培養(yǎng)瓶中加入含(10%FBS、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的細胞培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)液2 ml終止消化，吹打成細胞懸液，再將其轉(zhuǎn)入離心管中離心(1000 r/min,3 min)，棄上清；③向離心管中加入2 ml DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，分裝至培養(yǎng)瓶中，通常1瓶可分裝為2瓶，然后向培養(yǎng)瓶中加入6 ml新的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)；④細胞2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時便可進行傳代。

1.3 實驗室檢查

1.3.1 MTT檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的U251細胞，經(jīng)胰酶消化，細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度，按照5000個細胞/孔，接種于96孔板，每孔200 μl(細胞懸液，細胞培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入用DMSO溶解的不同濃度的塞來昔布(0、10、20、40、80 μmol/L)，以不加細胞僅加培養(yǎng)液的平行孔作為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。每個濃度分別測量3個復孔，每孔加入20 μl MTT后，將孔板放入CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心將培養(yǎng)液吸出，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶標儀測量每孔在570 nm處的光密度(OD)值(以實驗孔OD值減去空白對照的OD值為其結(jié)果)，每次試驗重復3次，取平均值，繪制細胞增殖曲線。

1.3.2 流式細胞儀檢測凋亡率 選用Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit檢測細胞凋亡率。用不含EDTA的胰酶消化收集處于對數(shù)生長期的U251細胞；用PBS洗滌細胞2次(2000 r/min離心5 min)，收集1.0×106細胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-APC，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；在1 h內(nèi)，進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 U251細胞的形態(tài)學觀察

2.1.1 U251細胞體外培養(yǎng)情況 U251細胞貼壁生長，呈單層排列，細胞排列緊密，分界清楚，呈多形性，以梭形為主，細胞可發(fā)出突觸，培養(yǎng)2～3 d后，細胞長滿瓶底的80%左右時進行傳代。

2.1.2 不同濃度塞來昔布干預后對U251細胞的影響

加入塞來昔布48 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：①空白對照組的膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)呈典型的膠質(zhì)瘤形態(tài)，細胞核規(guī)則，胞漿無明顯改變，核仁明顯；②用藥10 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)異形細胞，細胞膜有不規(guī)則突起，部分細胞變??；③用藥20 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細胞數(shù)量有所減少，部分細胞縮小，細胞膜不規(guī)則突起增多；④用藥40 μmol/L 48 h的膠質(zhì)瘤細胞數(shù)目明顯減少，大部分細胞縮小，變形細胞增多，有不規(guī)則突起的細胞增多；⑤用藥80 μmol/L 48 h異形細胞明顯增多，細胞核仁不明顯，脫落細胞增多，細胞分裂相減少。見圖1。

2.2 MTT檢測細胞增值情況

80 μmol/L塞來昔布對U251細胞的抑制作用明顯強于0 μmol/L塞來昔布的抑制作用(P＜0.01)。見表1。

2.3 流式細胞儀檢測塞來昔布干預前后人膠質(zhì)瘤細胞U251的凋亡率

80 μmol/L塞來昔布處理48 h的U251細胞凋亡率(17.86%)較未處理(11.23%)增高(P＜0.05)。見圖2。

表1 塞來昔布對人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞活性的影響(OD值)

圖1 不同濃度塞來昔布干預后對U251細胞的影響(100×)

圖2 流式細胞儀檢測塞來昔布干預前后人膠質(zhì)瘤U251細胞的凋亡率

3 討論

由于膠質(zhì)瘤多呈侵潤性生長，增殖速度快，外科手術(shù)難以做到全切，術(shù)后復發(fā)率很高，是制約臨床治療效果的重要因素。本研究所選用的U251膠質(zhì)瘤細胞株和人體真實的膠質(zhì)瘤的生物學特性有很強相似性，通常作為研究膠質(zhì)瘤最常用的細胞株。以塞來昔布為代表的Cox-2選擇性抑制劑，具有低毒性、胃腸道副作用小、長期服用耐受性好等特點。

NSAIDs抗腫瘤的機制目前尚未明確。NSAIDs作為經(jīng)典的Cox-2抑制劑，除了有明顯的消炎作用外，其機制可能有以下幾點非Cox-2依賴性機制。①促進腫瘤細胞的凋亡：阿司匹林可以通過抑制核因子κB (NF-κB)途徑來促進凋亡；激活過氧化酶體增殖激動劑受體(PPAR)γ促進凋亡；②增加傳統(tǒng)化療藥的療效；③NSAIDs激活RECK基因高表達，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物抑制至少三種基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP，MMP-2及MMP-9)，進而抑制腫瘤的血管形成及轉(zhuǎn)移。

有實驗證明，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中Cox-2和MMP-2均高表達，且Cox-2與膠質(zhì)瘤的遷移侵襲相關(guān)[5]。為了進一步明確塞來昔布對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的體外增殖抑制效應，本實驗設(shè)置了不同藥物濃度和作用時間。實驗表明，經(jīng)不同濃度塞來昔布作用后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)學和貼壁能力隨時間發(fā)生相應的變化，發(fā)生形態(tài)學變化及貼壁能力下降的細胞比例隨藥物作用時間的延長和藥物濃度的增加而明顯增加；未經(jīng)塞來昔布作用的對照組細胞分裂增殖旺盛，細胞呈梭形貼壁生長。塞來昔布對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251有極為明顯的抑制作用，其抑制作用呈現(xiàn)時間及濃度依賴性。隨著塞來昔布濃度的增加，細胞的增殖受到明顯的抑制，并且可促進腫瘤細胞的凋亡發(fā)生，體現(xiàn)了塞來昔布具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251增殖和促進其凋亡的作用，其機制可能是塞來昔布通過抑制Cox-2，進而上調(diào)U251細胞中P53的表達來抑制腫瘤細胞的生長，達到抗腫瘤的效果有關(guān)，但這方面的結(jié)論還有待進一步的實驗證實。臨床研究表明，大劑量且長時間使用塞來昔布能增加心血管不良事件的發(fā)生[6]，因此，將塞來昔布在安全劑量范圍內(nèi)對腫瘤進行臨床治療，還需要更多研究來證實。

[1]陳金緒,李建安,陳月鑫.巢蛋白和血管內(nèi)皮生長因子在腦膠質(zhì)瘤患者中的表達[J].神經(jīng)解剖學雜志,2011,27(6): 685-688.

[2]范存剛,周景儒,張慶俊.間充質(zhì)干細胞在腦膠質(zhì)瘤實驗性靶向治療中的應用[J].國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志,2010,37 (1):22-25.

[3]蘇偉,劉福生,朱貴東,等.人腦膠質(zhì)瘤中轉(zhuǎn)化生長因子β2、Smad3蛋白表達及臨床意義[J].中國康復理論與實踐,2011, 17(5):433-436.

[4]劉柏麟,章翔.膠質(zhì)細胞瘤的侵襲機制及分子靶向治療研究進展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2007,6(6):568-570.

[5]Lu DY,Leung YM,Huang SM,et al.Bradykinin-induced cell migration and COX-2 production mediated by the bradykinin B1 receptor in glioma cells[J].J Cell Biochem,2010,110(1): 141-150.

[6]Arber N.Cyclooxygenase-2 inhibitors in colorectal cancer prevention:point[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2008,17 (8):1852-1857.

Effect of Celecoxib on Proliferation and Apoptosis of U251 Glioma Cells

FENG Chen,FENG Hua,WEN Hong-li,et al.Department of Neurosurgery,Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China

ObjectiveTo explore the effect of celecoxib on proliferation and apoptosis of the glioma cells.MethodsThe glioma cell U251 was used and disposed with different densities of celecoxib(0 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L and 80 μmol/L)for 24 h,48 h and 72 h.The methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was used to detect the tumor cell proliferation and flow cytometry was used to detect the tumor cell apoptosis rate.ResultsThe Glioma U251 cells proliferation were significantly decreased with the increase of density of celecoxib in vitro,and there was significant difference in the inhibited rate in different density and different time(P＜0.05).The apoptosis rate was higher in the density of 80 μmol/L(17.86%)than in that of 0 μmol/L(11.23%)(P＜0.05).ConclusionCelecoxib can inhabit the proliferation of glioma U251 cells,and promote the apoptosis especially with the density of 80 μmol/L.

glioma;U251 cell;celecoxib;proliferation;apoptosis

R730.2

A

1006-9771(2013)06-0532-04

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金項目(No.YJSCX2011-386HLJ)。

2013-03-01

2013-04-19)

1.牡丹江醫(yī)學院，a：紅旗醫(yī)院普外科；b：病理生理學教研室；c：外語教研室，黑龍江牡丹江市157011；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江佳木斯市154002。作者簡介：馮晨(1984-)，男，漢族，黑龍江牡丹江市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：腫瘤發(fā)病機制。通訊作者：劉勁睿(1967-)，男，漢族，黑龍江佳木斯市人，碩士，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦缺血對記憶的影響。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.06.009