原威，王以朋，吳志宏，于斌

c-Jun氨基末端激酶信號通路抑制對白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響①

原威，王以朋，吳志宏，于斌

目的 研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路抑制對白細(xì)胞介素-1(IL-1)誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響，為阻止椎間盤退變提供新的治療靶點(diǎn)。方法分離培養(yǎng)大鼠尾椎纖維環(huán)細(xì)胞，IL-1刺激纖維環(huán)細(xì)胞后，Western blot檢測JNK信號通路的激活；傳代的纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，以IL-1(10 ng/ml)加或不加JNK通路抑制劑SP600125刺激24 h，Real-Time PCR檢測JNK通路抑制對IL-1誘導(dǎo)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響。結(jié)果JNK通路抑制可顯著抑制IL-1引起的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧合酶-2(Cox-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13表達(dá)上調(diào)，同時，可顯著逆轉(zhuǎn)IL-1引起的Ⅰ型膠原和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論JNK通路抑制可作為阻斷IL-1誘導(dǎo)的椎間盤退變的治療靶點(diǎn)。

纖維環(huán)細(xì)胞；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；c-Jun氨基末端激酶；白細(xì)胞介素-1；大鼠

[本文著錄格式]原威，王以朋，吳志宏，等.c-Jun氨基末端激酶信號通路抑制對白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(4):341-345.

椎間盤退變是下腰痛的主要原因。近年來研究顯示，炎性介質(zhì)在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用[1]，其中以白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1的作用最為顯著[2]。因此，阻斷IL-1發(fā)揮效應(yīng)的信號通路可作為椎間盤退變的治療靶點(diǎn)。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是一條重要的炎性信號通路。對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的研究顯示[3]，阻斷JNK信號通路可顯著降低IL-1誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和聚集蛋白聚糖酶(帶有血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域單元的裂解素和金屬蛋白酶，a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)表達(dá)，表明JNK信號通路可作為阻止IL-1誘導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解的治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于JNK信號通路在IL-1誘導(dǎo)的椎間盤細(xì)胞基質(zhì)降解中作用的研究較少。本文探討JNK通路抑制對IL-1誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響，從而為阻斷椎間盤退變尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1×P/S：GIBCO，美國；Ⅱ型膠原酶、鏈酶蛋白酶：SIGMA，美國；倒置相差顯微鏡：LEICA，德國；CO2培養(yǎng)箱：Thermo，美國；重組大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)：PeproTech，美國；JNK通路阻斷劑SP600125：SIGMA，美國；Trizol：Invitrogen，美國；TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?II(Perfect Real-Time)試劑盒：寶生物工程(大連)有限公司；磷酸化JNK一抗、JNK一抗：Cell Signaling Technology，美國；引物合成：上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；定量PCR儀：ABI 7500，美國。

1.2 大鼠尾椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞分離培養(yǎng)

3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠10只，體重(350± 20)g，由北京大學(xué)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(京)2011-0012。大鼠稱重后麻醉，脫頸處死，無菌條件下整段取出尾椎，分離尾椎間盤，清除尾椎周圍韌帶，小刮匙刮除髓核，把同一只大鼠尾椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)收集到6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS洗3遍，將纖維環(huán)組織剪成約1 mm3大小的碎塊，轉(zhuǎn)移到15 ml離心管內(nèi)，0.4%鏈霉蛋白酶37℃消化90 min，每15分鐘搖晃1次，0.025%Ⅱ型膠原酶、0.01%Ⅴ型透明質(zhì)酸酶37℃搖床(110 r/min)消化過夜，200目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集懸液，2000 r/min離心5 min，含10% FBS、1×P/S的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，以1×105/ml接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞達(dá)到90%匯合時，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，完全培養(yǎng)基重懸后以1×105/孔接種到六孔板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 IL-1對大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的刺激

六孔板中的細(xì)胞長至80%融合(約48 h)后，血清饑餓過夜，加入含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，以10 ng/ml大鼠重組IL-1β分別刺激5 min、15 min、30 min、60 min、90 min。刺激結(jié)束后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測IL-1誘導(dǎo)的JNK信號通路激活

六孔板每孔加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解緩沖液100 μl，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸5 min，取20 μg蛋白樣品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，p-JNK和JNK一抗(1∶1000)4℃過夜，TBST 5min洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法(BeyoECL Plus試劑，碧云天生物技術(shù)公司)顯色，然后曝光顯影。用Quantity One分析軟件對顯影條帶進(jìn)行灰度分析，用p-JNK與JNK灰度值的比值表示p-JNK的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 JNK信號通路抑制

六孔板中細(xì)胞長至80%融合后，更換無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，細(xì)胞血清饑餓過夜，分別設(shè)：①對照組：加入含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基；②IL-1組：1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入10 ng/ ml IL-1β；③JNK通路抑制組：1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入5 μmol/L或10 μmol/L SP600125，1 h后加入10 ng/ml IL-1β。由于SP600125溶解于DMSO，因此，對照組和IL-1組也加入相應(yīng)體積的DMSO。24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.6 Real-Time PCR檢測

Real-Time PCR檢測四類基因的表達(dá)：①炎性基因和分解代謝基因：誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6、環(huán)氧合酶-2(Cox-2)、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5；②基質(zhì)組分基因：Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,Agg)；③合成代謝基因：胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)；④抗分解代謝基因：金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

按Trizol說明書提取總RNA，Real-Time PCR檢測采用TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?II(Perfect Real-Time)試劑盒，按說明書以兩步法進(jìn)Real-Time PCR反應(yīng)，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃30 s預(yù)變性，95℃5 s、60℃34 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，降溫至4℃。

按2-ΔΔCt相對定量分析結(jié)果，結(jié)果表示為實(shí)驗(yàn)組相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性后，采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β激活大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中JNK信號通路

Western blot結(jié)果顯示，IL-1β刺激5 min后，p-JNK蛋白表達(dá)顯著增加，表明JNK信號通路激活，在刺激90 min時，仍可檢測到p-JNK蛋白的表達(dá)，表明此時仍存在JNK信號通路的激活。IL-1β對JNK總蛋白的表達(dá)無影響。見圖1、圖2。

圖1 IL-1β激活大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)JNK信號通路

圖2 IL-1β刺激不同時間點(diǎn)p-JNK蛋白的表達(dá)

2.2 SP600125抑制JNK信號通路對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響

IL-1β顯著上調(diào)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞iNOS、IL-6、Cox-2、MMP-3、MMP-13的基因表達(dá)，分別為對照組的237.6、140.3、111.2、27.3、50.7倍，5 μmol/L或10 μmol/L SP600125顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的上述基因表達(dá)；IL-1β使ADAMTS-4，ADAMTS-5的表達(dá)分別上調(diào)為對照組的1.9和2.4倍，JNK通路抑制對IL-1β誘導(dǎo)的ADAMTS-4，ADAMTS-5的表達(dá)無影響。IL-1β使aggrecan基因表達(dá)增加3倍，JNK通路抑制對此無顯著影響；IL-1β使Ⅰ型膠原表達(dá)降低為對照組的0.13倍，5 μmol/L或10 μmol/L SP600125分別使Ⅰ型膠原的表達(dá)增加為對照組的0.5和0.6倍。IL-1β使IGF-1的表達(dá)降低為對照組的0.27倍，5 μmol/L或10 μmol/L SP6000125使IGF-1基因表達(dá)分別增高為對照組的0.53和0.63倍。IL-1β輕度增加大鼠纖維環(huán)細(xì)胞TGF-β的表達(dá)至對照組的1.2倍，但與對照組相比無顯著性差異，JNK通路抑制可進(jìn)一步增加TGF-β的表達(dá)。IL-1β上調(diào)TIMP-1的表達(dá)至對照組的2.4倍，JNK通路抑制可顯著阻止IL-1誘導(dǎo)的TIMP-1表達(dá)上調(diào)。見圖3。

3 討論

炎性因素在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用。退變椎間盤細(xì)胞可產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)[4-5]。本研究顯示，IL-1刺激大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞可顯著上調(diào)iNOS、IL-6、Cox-2的表達(dá)，這些炎性基因的蛋白產(chǎn)物在椎間盤退變過程中發(fā)揮重要作用。NO可顯著抑制蛋白多糖的合成[6]，同時在椎間盤突出導(dǎo)致的疼痛中發(fā)揮重要作用。NO還可誘導(dǎo)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡[7]。IL-6在椎間盤退變引起的疼痛中發(fā)揮重要作用[8]。Studer等研究顯示，IL-6可顯著下調(diào)椎間盤細(xì)胞膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，加劇IL-1引起的蛋白多糖合成下調(diào)[9]。此外，IL-6還可上調(diào)椎間盤細(xì)胞MMP-3和MMP-13的表達(dá)，從而促進(jìn)基質(zhì)降解。Cox-2調(diào)節(jié)PGE2的合成，后者可致敏感覺神經(jīng)元，引起疼痛[10]。PGE2還參與椎間盤基質(zhì)降解。Sowa等研究顯示，PGE2可下調(diào)髓核細(xì)胞aggrecan基因表達(dá)和蛋白多糖的合成，同時降低Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達(dá)[11]。本研究顯示，JNK通路抑制可顯著阻止IL-1引起的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞iNOS、IL-6、Cox-2表達(dá)上調(diào)，表明JNK通路在IL-1誘導(dǎo)的炎性基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。

椎間盤退變的典型改變是基質(zhì)合成代謝和分解代謝失衡。MMPs和ADAMTS在椎間盤基質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用。MMPs主要降解膠原纖維，而ADAMTS主要降解基質(zhì)蛋白多糖。本研究顯示，JNK通路抑制可顯著降低IL-1誘導(dǎo)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞MMP-3、MMP-13表達(dá)，表明JNK通路可作為阻止IL-1引起基質(zhì)分解代謝的治療靶點(diǎn)。

圖3 JNK信號通路抑制對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基因表達(dá)的影響

這與在軟骨細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)類似，Sylvester等研究表明，JNK通路抑制顯著降低IL-1誘導(dǎo)的牛軟骨細(xì)胞MMP-3和MMP-13表達(dá)上調(diào)[3]。

JNK通路抑制對IL-1誘導(dǎo)的ADAMTS-4、ADAMTS-5表達(dá)上調(diào)無顯著影響，這與Ellman等的研究結(jié)果不同[12]。該研究顯示，JNK通路抑制顯著降低IL-1誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)上調(diào)。這可能是由于細(xì)胞種類和動物種屬的差異所致。因同一信號通路在細(xì)胞中的作用因細(xì)胞種類和刺激物不同而不同。

本研究顯示，IL-1輕度上調(diào)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞aggrecan基因的表達(dá)，這與既往的大多數(shù)報道相反。以前的研究均認(rèn)為IL-1刺激降低椎間盤細(xì)胞aggrecan的表達(dá)，這可能與我們所用的細(xì)胞是纖維環(huán)細(xì)胞有關(guān)，而之前的大多數(shù)研究均以髓核細(xì)胞為研究對象。JNK通路抑制對IL-1誘導(dǎo)的aggrecan基因表達(dá)無顯著影響，表明JNK信號通路并不參與IL-1引起的纖維環(huán)細(xì)胞aggrecan表達(dá)上調(diào)。Ⅰ型膠原是纖維環(huán)主要的細(xì)胞外基質(zhì)組分，IL-1刺激顯著降低Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，JNK通路抑制逆轉(zhuǎn)IL-1引起的Ⅰ型膠原基因表達(dá)下調(diào)，表明，JNK通路抑制有助于阻止IL-1引起的椎間盤基質(zhì)組分的降解。

TGF-β和IGF-1是重要的基質(zhì)合成代謝因子，它們可上調(diào)椎間盤細(xì)胞aggrecan，Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)基質(zhì)合成[13]。本研究顯示，IL-1顯著降低大鼠纖維環(huán)細(xì)胞中IGF-1基因的表達(dá)，JNK通路抑制可逆轉(zhuǎn)IL-1引起的IGF-1表達(dá)下調(diào)。這表明，JNK信號通路參與IL-1對椎間盤細(xì)胞IGF-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。IL-1對纖維環(huán)細(xì)胞TGF-β基因表達(dá)無顯著影響，但在IL-1存在的情況下，JNK通路抑制增加了TGF-β的表達(dá)，表明JNK通路在IL-1對椎間盤細(xì)胞基質(zhì)合成代謝基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

TIMP-1具有抗分解代謝效應(yīng)，它可以拮抗MMP-3的基質(zhì)降解效應(yīng)。本研究顯示，IL-1上調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)，這可能是椎間盤細(xì)胞對IL-1誘導(dǎo)的基質(zhì)降解的一種自我保護(hù)效應(yīng)；然而，由于IL-1刺激更顯著增加了MMP-3的表達(dá)，因此MMP-3/ TIMP-1的比例上調(diào)，從而引起基質(zhì)分解代謝增加。JNK通路抑制降低了IL-1誘導(dǎo)的TIMP-1基因表達(dá)上調(diào)，表明JNK通路參與了IL-1對椎間盤細(xì)胞TIMP-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。

本研究用大鼠椎間盤細(xì)胞，這可能導(dǎo)致我們的結(jié)果與JNK通路抑制對人椎間盤細(xì)胞的效應(yīng)有所差別。由于正常的人椎間盤細(xì)胞很難獲取，手術(shù)中獲取的椎間盤組織由于嚴(yán)重退變很難以肉眼分辨其是髓核還是纖維環(huán)，因此我們選用大鼠椎間盤細(xì)胞作為研究對象。大鼠是目前研究椎間盤退變病理生理最常用的動物；由于動物髓核組織包括髓核細(xì)胞和脊索細(xì)胞，脊索細(xì)胞會影響髓核細(xì)胞對刺激的反應(yīng)[14-15]，因此我們選用內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞作為研究對象，以保證細(xì)胞的均質(zhì)性。

近年來，椎間盤退變的生物學(xué)療法已成為研究熱點(diǎn)，其中阻斷IL-1對椎間盤細(xì)胞的基質(zhì)降解效應(yīng)是最有潛力的一種方法。我們的研究顯示，JNK信號通路抑制可阻斷IL-1引起的椎間盤細(xì)胞炎性和分解代謝基因表達(dá)，表明抑制JNK通路可能是椎間盤退變的有效治療靶點(diǎn)。

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Effect of c-Jun N-terminal Kinase Inhibition on Gene Expression Induced by Interleukin-1 in Annulus Fibrosus Cells in Rats

YUAN Wei,WANG Yi-peng,WU Zhi-hong,et al.Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Department of Orthopaedic Surgery,Peking Union Medical College Hospital,Beijing 100730,China

ObjectiveTo determine the role of c-Jun N-terminal kinase(JNK)signaling in annulus fibrosus cells response to interleukin (IL)-1.MethodsRat annulus fibrosus cells cultured in monolayer were exposed to IL-1,with or without JNK inhibition by SP600125.RNA was isolated for Real-Time polymerase chain reaction(PCR)after 24 h stimulation.ResultsIL-1 upregulation of mRNA for inducible nitric oxide synthase(iNOS),IL-6,cyclooxygenase(Cox)-2,matrix metalloproteinase(MMP)-3,MMP-13 were blunted by JNK inhibition,while downregulation of collagenⅠand insulin-like growth factor(IGF)-1 were also reversed by JNK inhibition.ConclusionJNK signaling inhibition can be a therapeutic target for blocking intervertebral disc degeneration induced by IL-1.

annulus fibrosus cells;signal transduction;c-Jun N-terminal kinase;interleukin-1;rats

R681.5

A

1006-9771(2013)04-0341-05

2012-12-28)

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京市 100730。作者簡介：原威(1983-)，男，漢族，山西河津市人，博士研究生，主要研究方向：脊柱外科學(xué)。通訊作者：王以朋，男，漢族，博士后，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：脊柱外科學(xué)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.04.006