邢恩鴻，邵雪齋，王旭丹，王 睿，張 麗△

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)教研室;3.北京理工大學(xué))

清開靈注射液對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞增殖的影響*

邢恩鴻1，邵雪齋1，王旭丹2，王 睿3，張 麗2△

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)教研室;3.北京理工大學(xué))

目的:研究清開靈注射液(QKL)在體外對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞增殖活化的影響。方法:常規(guī)制備小鼠脾細(xì)胞，觀察T細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)加ConA，觀察B細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)加LPS。采用MTT法觀察不同濃度QKL對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞增殖活化的作用。結(jié)果:不同濃度的QKL(1/3200及以上)對(duì)脾B細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P＜0.01)。高濃度QKL(1/400及以上)對(duì)脾T細(xì)胞增殖具有抑制作用，低濃度QKL(1/800以下)對(duì)脾T細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用(P＜0.01)。結(jié)論:QKL可通過(guò)影響T、B細(xì)胞的活化增殖調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

清開靈注射液;脾;T細(xì)胞;B細(xì)胞;細(xì)胞增殖

清開靈注射液(QKL)是在古方“安宮牛黃丸”的基礎(chǔ)上，精選多種中藥研制而成的一種純中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、鎮(zhèn)驚安神、醒神開竅等功效。在臨床上主要用于治療感染性疾病、腦血管疾病、傳染性疾病和自身免疫性疾病等[1-3]。隨著QKL臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，有關(guān)其治療機(jī)制的研究亦日趨深入，但主要集中于腦血管疾病、感染、發(fā)熱性疾病等方面，對(duì)QKL免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究較少[4-6]。為此，本研究探討了QKL在體外對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞體外活化、增殖的影響，以期為QKL在臨床上治療免疫相關(guān)性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 QKL，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠;LPS、ConA、甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國(guó)Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)液，美國(guó)Gibco公司。動(dòng)物:清潔級(jí)雌性C57Bl/6小鼠，體重18-20g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(京)2002-0003。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備:斷頸處死小鼠，無(wú)菌分離脾臟，置不完全1640培養(yǎng)液中，用50目鋼網(wǎng)研磨制成單個(gè)細(xì)胞懸液，1500r/min離心5min，棄上清。沉淀用雙蒸水(低滲法)破壞紅細(xì)胞，雙鹽水恢復(fù)等滲后，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1500r/min離心5min后棄上清。收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，用完全1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml。

1.2.2 淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將密度為5×106/ml的淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，觀察T細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)加ConA，終濃度為5?g/ml;觀察B細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)加LPS，終濃度為50?g/ml。同時(shí)設(shè)單純1640培養(yǎng)液細(xì)胞對(duì)照孔。加入不同稀釋度的QKL，設(shè)1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400八個(gè)稀釋度，分別將100?l不同稀釋度的QKL加入板中，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72h。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入MTT溶液20μl后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)板3000r/ min離心5min，棄上清，用濾紙吸去水分后，每孔加入酸化異丙醇100μl，靜置15min，輕輕混勻后，492nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

小鼠脾細(xì)胞在ConA刺激72h后，OD值為0.405± 0.044，與單純1640培養(yǎng)液(0.073±0.007)比較，脾T細(xì)胞明顯增值活化(P＜0.05);LPS刺激72h后，OD值為0.612±0.025，與單純1640培養(yǎng)液(0.125±0.019)比較，小鼠脾B細(xì)胞增值活化明顯(P＜0.05)。

QKL對(duì)小鼠脾B細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，除1/ 6400 QKL與LPS對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，從1/3200 QKL即開始顯示出明顯的抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性(P＜0.01)。見附表。

QKL對(duì)小鼠脾T細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促進(jìn)的作用。QKL稀釋度為1/800到1/3200時(shí)，表現(xiàn)出明顯的促T細(xì)胞增殖的作用，且呈劑量依賴性(P＜0.01);QKL的濃度增大至1/400以上時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)T細(xì)胞增殖明顯的抑制作用(P＜0.01)。見附表。

附表 QKL對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞增殖的影響(OD值，±s)

附表 QKL對(duì)小鼠脾T、B細(xì)胞增殖的影響(OD值，±s)

與1640培養(yǎng)液比較:#P＜0.05;與T或B細(xì)胞對(duì)照比較:P＜0.01

組別 B細(xì)胞 (492nm) T細(xì)胞(492nm) 1640培養(yǎng)液 0.125±0.019 0.073±0.007 LPS對(duì)照 0.612±0.025# -ConA對(duì)照 - 0.405±0.044#50-1清開靈 0.137±0.017* 0.078±0.008*100-1清開靈 0.263±0.026* 0.092±0.0007*200-1清開靈 0.474±0.091* 0.174±0.016*400-1清開靈 0.457±0.040* 0.324±0.023*800-1清開靈 0.484±0.038* 0.480±0.037*1600-1清開靈 0.486±0.034* 0.538±0.023*3200-1清開靈 0.519±0.040* 0.520±0.051*6400-1清開靈 0.614±0.034 0.454±0.071

3 討論

T、B細(xì)胞是機(jī)體執(zhí)行適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要免疫細(xì)胞。B細(xì)胞不僅能通過(guò)產(chǎn)生抗體發(fā)揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原提呈細(xì)胞。T細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，可分為不同的亞群，各亞群之間相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮免疫功能;T細(xì)胞除可介導(dǎo)適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，在胸腺依賴抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要的輔助作用[7]。

免疫應(yīng)答可分為固有性免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，二者相輔相成、密不可分。適應(yīng)性免疫是機(jī)體對(duì)抗內(nèi)源性與外源性“非己”成分的最終屏障，并且其效應(yīng)分子可大大促進(jìn)固有免疫應(yīng)答，免疫病理及免疫性相關(guān)疾病的發(fā)生均與適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程異常有關(guān)。適應(yīng)性免疫應(yīng)答可分為三個(gè)階段:識(shí)別階段、活化增殖階段和效應(yīng)階段。在識(shí)別階段，T、B細(xì)胞分別通過(guò)TCR與BCR精確識(shí)別抗原;在活化增殖階段，識(shí)別抗原后的淋巴細(xì)胞在協(xié)同刺激分子的參與下，細(xì)胞發(fā)生活化、增殖和分化，產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞、效應(yīng)分子和記憶細(xì)胞;最后是效應(yīng)階段，效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子清除抗原。因此，調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的活化增殖可作為理想的免疫干預(yù)措施。

本研究應(yīng)用MTT法觀察QKL在體外對(duì)T、B細(xì)胞活化增殖的影響。結(jié)果顯示，ConA刺激72h、LPS刺激72h，小鼠脾T細(xì)胞、B細(xì)胞分別明顯增殖活化;加入不同濃度的QKL后，1/3200濃度的QKL對(duì)脾B細(xì)胞即有明顯的抑制增殖作用，且抑制作用呈明顯的劑量依賴性。有文獻(xiàn)報(bào)道，QKL可明顯降低ConA刺激的脾T細(xì)胞的增殖指數(shù)，且呈一定的濃度依賴性[8]。但本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(1/400及以上)QKL對(duì)T細(xì)胞增殖具有抑制作用，低濃度(1/800及以下)QKL對(duì)T細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。因此表明，QKL是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，其治療自身免疫性疾病的機(jī)制可能是通過(guò)影響T、B細(xì)胞的活化增殖調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

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INFLUENCE OF QINGKAILING INJECTION ON PROLIFERATION OF MOUSE SPLEEN T AND B LYMPHOCYTES

XING En-hong, SHAO Xue-zhai, WANG Xu-dan, et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the inf l uence of Qingkailing injection (QKL) on proliferation of mouse spleen T and B lymphocytes in vitro.Methods:Concanavalin A was added to mouse spleen lymphocytes to activate T lymphocytes and LPS to activate B lymphocytes. MTT method was used to observe the effects of QKL of different concentration on mouse spleen T and B lymphocytes proliferation.Results:QKL of different concentration (1/3200 and above) could obviously inhibit proliferation of spleen B lymphocytes, and showed dose dependent (P＜0.01). High concentration QKL (1/400 and above) could inhibit proliferation of spleen T lymphocytes, while low concentration QKL (below 1/800) could promote proliferation of spleen T lymphocytes (P＜0.01).Conclusions:QKL can regulate immune reaction by inf l uencing the proliferation of T and B lymphocytes.

Qingkailing injection; Spleen; T lymphocytes; B lymphocytes; Cell proliferation

R285.5

A

1004-6879(2013)01-0003-03

2012-06-10)

* 承德市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(200922070)

△ 通訊作者