林明霞，李涂藍(lán)，潘冬貴，黃鎖義*

(右江民族醫(yī)學(xué)院，a.藥學(xué)院；b.臨床學(xué)院，廣西 百色 533000)

雞骨草醇提物體外抗氧化自由基作用研究

林明霞a，李涂藍(lán)a，潘冬貴b，黃鎖義a*

(右江民族醫(yī)學(xué)院，a.藥學(xué)院；b.臨床學(xué)院，廣西 百色 533000)

目的 測(cè)定雞骨草醇提物體外抗氧化自由基作用，為充分利用雞骨草資源提供理論依據(jù)。方法 雞骨草飲片以65%乙醇作為溶劑，pH=3條件下浸泡24 h，通過(guò)分光光度法測(cè)定雞骨草醇提物清除超氧自由基(·O2-)、羥自由基(·OH)能力和清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力，普魯士法測(cè)定其還原Fe3+能力，并以丁基羥基茴香醚(butylated hydroxylanisole，BHA)作對(duì)照測(cè)定雞骨草醇提物對(duì)金屬離子Fe2+螯合能力。結(jié)果 雞骨草醇提物具有較強(qiáng)的清除·O2-、·OH、DPPH自由基能力，并能還原Fe3+和螯合Fe2+。結(jié)論 雞骨草醇提物具有較強(qiáng)抗氧化作用，其抗氧化性隨著濃度的增大而增強(qiáng)。

雞骨草；醇提物；抗氧化作用；清除；自由基；螯合

雞骨草是豆科相思子屬的植物，常見(jiàn)于中國(guó)華南地區(qū)，自然生長(zhǎng)于深山隱谷處，氣味辛、甘，性質(zhì)溫和，香氣四溢。藥用干燥全株，有清熱利濕、解毒止痛的功效，對(duì)急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛等療效顯著。雞骨草全草主要含相思子堿、甾醇化合物、皂苷、黃酮類(lèi)、大黃酚、大黃素甲醚、氨基酸、膽堿、蒽醌類(lèi)等化合物[1-3]。為進(jìn)一步拓展其應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)以雞骨草作為原料，研究了其醇提液體外抗氧化自由基作用，為開(kāi)發(fā)和利用雞骨草的藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑與設(shè)備

1.1 材料

雞骨草干品(產(chǎn)于廣西玉林，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族中藥學(xué)教研室劉春榮副教授鑒定為Abrus cantoniensis Hance的干燥全草)，粉碎，于65%乙醇pH=3室溫中浸泡24 h[4]，過(guò)濾后低溫濃縮，自然晾干成浸膏備用。

1.2 試劑

鹽酸(西隴化工股份有限公司，批號(hào)：110725)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20051010)；鄰苯三酚(貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司，批號(hào)：080112)；水楊酸(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20070722)；硫酸亞鐵(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20040712)；過(guò)氧化氫(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：110120)；無(wú)水乙醇(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20111008)；DPPH (Aladdin industrial Corporation，批號(hào)：H1201006)；磷酸鹽緩沖液(上海雷磁創(chuàng)益儀器表有限公司，批號(hào)：20011211)；鐵氰化鉀(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20050425)；三氯乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20050409)；三氯化鐵(上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20050328)；BHA (Aladdin industrial Corporation，批號(hào)：45023)；菲洛嗪(Aladdin industrial Corporation，批號(hào)：H1201006)。

1.3 儀器

GN2085電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-DIII循環(huán)真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HHS-21-4電熱式恒溫水浴(江蘇金壇宏凱儀器廠)；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 雞骨草醇提液的制備

分別稱(chēng)取雞骨草浸膏若干，用65%乙醇溶解后定容于100 mL量瓶，配成不同濃度的溶液備用。

2.2 雞骨草醇提液體外抗活性氧自由基作用研究

2.2.1 雞骨草醇提液清除超氧自由基(·O2-)作用取pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.50 mL于干燥具塞比色管中，加入3.20 mL蒸餾水，混勻后置25 ℃恒溫水浴預(yù)熱20 min，取出后分別加入在25 ℃恒溫水浴預(yù)熱20 min的濃度為0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg·mL-1的樣品1.00 mL和3 mmol·L-1的鄰苯三酚0.30 mL，混勻后靜置反應(yīng)4 min，立即加入10 mmol·L-1HCl 2滴終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液做參比，在321 nm處測(cè)定吸光度A。按下式計(jì)算清除率：

其中，A0：加鄰苯三酚但不加樣品時(shí)的吸光度；A1：加樣品和鄰苯三酚時(shí)的吸光度；A2：加樣品但不加鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

隨著雞骨草醇提物濃度的增加，對(duì)·O2-清除能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.10 mg·mL-1時(shí)，清除率即超過(guò)IC50，說(shuō)明雞骨草對(duì)超氧自由基有很強(qiáng)的清除能力。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度的雞骨草醇提物對(duì)超氧自由基的清除能力Fig 1 The oxygen radical scavenging capacity of different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba

2.2.2 清除羥基自由基能力 采用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥基自由基。利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，向體系中加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，在10 mL具塞比色管中依次加9 mmol·L-1FeSO41 mL，9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，充分混勻后分別加入濃度為0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 mg·mL-1的雞骨草醇提物溶液2.00 mL，最后加入8.8 mmol·L-1H2O22 mL啟動(dòng)反應(yīng)，室溫反應(yīng)1 h，并與空白液比較，于510 nm處測(cè)定其吸光度，平行3次。按下式計(jì)算清除率：

其中，A1：空白對(duì)照液的吸光度；A2：加樣品時(shí)的吸光度。

雞骨草提取液對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除作用，0.05 mg·mL-1時(shí)清除率即有36.2%，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg·mL-1時(shí)，清除率即超過(guò)IC50，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的雞骨草醇提物對(duì)羥自由基的清除率變化關(guān)系Fig 2 The relationship between different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba and the clear rate of ·OH

2.2.3 清除DPPH自由基能力 DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈紫色，具有單一電子，能接受一個(gè)電子或氫離子，與氧化劑發(fā)生反應(yīng)，提H被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色，在波長(zhǎng)為517 nm下具有最大吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。以高濃度逐漸稀釋的方式檢測(cè)不同濃度樣品溶液對(duì)自由基的清除率，以自由基清除率為50%是樣品的濃度(IC50)來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。

取新配制的(6×10-4mol·L-1)DPPH溶液0.5 mL，分別加入濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·mL-1的樣品溶液，混勻后用無(wú)水乙醇定容至5 mL，室溫下暗光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度A，平行3次。按下式計(jì)算清除率。

其中，A1：空白吸光度(t=0 min)；A2：反應(yīng)30 min后吸光度。

在一定的濃度范圍內(nèi)，雞骨草對(duì)DPPH自由基的清除效率和濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著醇提物濃度的增加，雞骨草對(duì)DPPH自由基的清除率也逐步增加。當(dāng)濃度達(dá)到0.08 mg·mL-1時(shí)清除率即超過(guò)IC50。這些結(jié)果說(shuō)明雞骨草醇提物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基具有一定的清除活性。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度的雞骨草醇提液對(duì)DPPH自由基的清除率變化關(guān)系Fig 3 The relationship between different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba and the clear rate of DPPH

2.2.4 還原Fe3+能力采用普魯士蘭法測(cè)定樣品還原Fe3+能力。在系列10 mL具塞比色管中依次加入2.5 mL濃度為0.01，0.02，0.05，0.10 mg·mL-1的樣品溶液，2.5 mL 0.2 mol·L-1pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，如溶液渾濁離心(3 000 r·min-1)10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm處測(cè)定吸光度值，吸光度值增加表明還原力增強(qiáng)。

隨著醇提物濃度的增大，還原Fe3+增強(qiáng)，吸光度增加，說(shuō)明雞骨草有一定的抗氧化作用，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度的雞骨草醇提液還原Fe3+變化關(guān)系Fig 4 The relationship between different concentrations the ethanol extracts of Abri Herba and reduction the ferric

2.2.5 金屬離子(Fe2+)螯合能力 取相同濃度不同體積的樣品及對(duì)照品BHA溶液于系列10 mL比色管中，加入0.2 mol·L-1FeSO40.1 mL溶液中，混勻，再加入5 mol·L-1菲洛嗪0.2 mL，用65%乙醇定容到5 mL，劇烈振蕩混合物后，室溫下放置10 min。試劑空白作參比，于562 nm處測(cè)定吸光度，平行3次。吸光度值越低表示金屬螯合能力越強(qiáng)。

其中，A0：不加樣品時(shí)的吸光度值；A1：加入樣品時(shí)的吸光度值。

雞骨草醇提液和BHA都有螯合Fe2+的能力，且隨著濃度的增大螯合能力增強(qiáng)，但BHA對(duì)Fe2+的螯合能力強(qiáng)于雞骨草醇提液。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 雞骨草醇提物、BHA對(duì)Fe2+的螯合能力Fig 5 The ability of ethanol extracts of Abri Herba and BHA chelating Fe2+

3 討論

雞骨草醇提物體外抗氧化性試驗(yàn)表明，雞骨草具有較強(qiáng)的還原能力，對(duì)自由基有良好的清除作用。雞骨草具有較強(qiáng)清除超氧自由基和羥自由基的能力；可作為電子供體，將Fe3+還原為Fe2+；當(dāng)醇提物濃度達(dá)到0.08 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH的清除率即超過(guò)IC50。雞骨草醇提物具有螯合Fe2+能力，但其螯合能力比BHA弱。

有資料顯示，自由基可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)解聚、核酸斷裂和多糖裂解等生化過(guò)程，引發(fā)組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的進(jìn)一步提高，人們對(duì)天然抗氧化物質(zhì)的需求量也逐年增加，對(duì)天然藥物的抗氧化活性的研究也逐漸增加[5-6]。從本實(shí)驗(yàn)可看出，雞骨草醇提物具有明顯的抗氧化作用，這預(yù)示著它在醫(yī)學(xué)和人類(lèi)保健事業(yè)上具有潛在的利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)為雞骨草的開(kāi)發(fā)利用提供了合理的依據(jù)。

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Study on the in Vitro Antioxidant Activity of the Ethanol Extracts from Abri Herba

LIN Mingxiaa, LI Tulana, PAN Dongguib, HUANG Suoyia*
(Youjiang Medical University for Nationalities, a.School of Pharmacy; b.School of Clinical Medicine, Baise 533000, China)

OBJECTIVE To study in vitro antioxidant activity of the ethanol extracts from Abri Herba, and provide the theory to make use of Abri Herba. METHODS Abri Herba was soaked for 24 h with 65% ethanol as solvent and under the condition of pH=3, the abilities of the ethanol extracts of clearing ·O2-, ·OH, and DPPH were assayed by spectrophotometry. The ability of reducing Fe3+was detected with Prussia methodand, and chelating Fe2+was detected comparison to BHA. RESULTS The ethanol extracts of Abri Herba could effectively clear ·O2-, ·OH and DPPH, and reduce Fe3+, chelate Fe2+. CONCLUTION The ethanol extracts of Abri Herba antioxidation is strong, and its antioxidant activity was enhanced with the increase of concentration.

Abri Herba; the ethanol extracts; anti-oxidant activity; scavenging; hydroxyl radical; chelating

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1047-04

2013-01-14

國(guó)家中醫(yī)藥管理局“十二五”中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥人教發(fā)[2012]32號(hào))；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA 019240)；2013年度右江民族醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(XJCCX201369)

林明霞，女 Tel: 18778683216 E-mail: linmingxia1@163.com*

黃鎖義，男，教授，碩導(dǎo) Tel: (0776)2850590 E-mail: huangsuoyi@163.com