羅 昱，梁 芳，李小鑫，丁筑紅*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

單寧酶對(duì)刺梨果汁單寧的脫除作用

羅 昱，梁 芳，李小鑫，丁筑紅*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

以刺梨果汁為原料，探討單寧酶對(duì)刺梨果汁中單寧的脫除效果，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定的最佳脫除條件。結(jié)果表明：?jiǎn)螌幟柑砑恿?.12%、pH4.5、脫除溫度45℃、脫除時(shí)間100min，在此條件下單寧脫除率達(dá)到76.07%，均高于明膠法和羧甲基殼聚糖法的脫除率，且單寧酶對(duì)刺梨果汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響不大，但對(duì)刺梨果汁混濁度無明顯影響。

單寧酶；刺梨果汁；單寧；脫除

刺梨(Roxburgh rose)為薔薇科多年生落葉灌木，是一種極具開發(fā)價(jià)值的野生植物資源。刺梨果中具有獨(dú)特的芳香味，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是含有豐富的VC、黃酮和SOD等營(yíng)養(yǎng)功效成分，素有“三王水果”之稱[1-2]，具有防癌、抗衰老等作用[3]。刺梨果實(shí)芳香濃郁，但單寧等多酚物質(zhì)含量較高，一般含量在0.6%～2.2%[4]，因而澀味重，過高的單寧含量對(duì)果汁產(chǎn)品穩(wěn)定性、澄清度、風(fēng)味、色澤等產(chǎn)生不利影響[4-6]，商品價(jià)值降低，因此，脫除單寧是解決刺梨果汁產(chǎn)品口感及變色的有效措施。

常用的去除單寧方法包括物理法、化學(xué)法及生物法。刺梨果汁單寧脫除方法中，廣泛采用化學(xué)方法，利用明膠、羧甲基殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)脫除單寧[7-8]；而生物方法主要是利用果膠酶和單寧酶的作用來去除單寧[9-10]，有報(bào)道[11-12]單寧酶可用于茶澄清和預(yù)防葡萄酒中沉積物，并且能有效脫除櫻桃李汁中的單寧物質(zhì)。本研究采用單寧酶生物法對(duì)刺梨果汁中單寧成分含量影響，探討單寧酶脫除刺梨果汁中單寧的最佳工藝條件及其對(duì)刺梨果汁品質(zhì)的影響，為刺梨果汁品質(zhì)提升提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨，本地人工種植果，充分成熟，新鮮無霉?fàn)€變質(zhì)。

單寧酶(食品級(jí)，酶比活力500U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 常州澳華儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；958-10L型真空包裝機(jī) 歐創(chuàng)包裝機(jī)械(武漢)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨汁制備

將新鮮刺梨挑選后清洗濾干水分，破碎壓榨取汁，待用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 單寧酶添加量對(duì)刺梨果汁單寧成分的影響

分別取50mL刺梨汁，添加不同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的單寧酶溶液，在pH4.5、40℃條件下進(jìn)行水解，處理60min后，測(cè)定刺梨果汁中單寧含量。

1.3.2.2 酶作用pH值對(duì)單寧成分的影響

取50mL刺梨汁，添加0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的單寧酶溶液，用檸檬酸調(diào)至不同pH值，分別在40℃條件下進(jìn)行水解，處理60min后，測(cè)定刺梨果汁中單寧含量。

1.3.2.3 脫除溫度對(duì)單寧成分的影響

取50mL刺梨汁，添加0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的單寧酶溶液，分別在不同溫度、pH4.5的條件下進(jìn)行水解，處理60min后，測(cè)定刺梨果汁中的單寧含量。

1.3.2.4 脫除時(shí)間對(duì)單寧成分的影響

取50mL刺梨汁，添加0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的單寧酶溶液，在pH4.5、40℃條件下，分別脫除不同時(shí)間后，測(cè)定果汁中單寧含量。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)單寧酶用量(A)、酶作用pH值(B)、脫除溫度(C)和脫除時(shí)間(D)4個(gè)因素各取3個(gè)水平，選用L9(34)正交試驗(yàn)確定總單寧最佳酶解工藝條件。

1.3.4 分析方法

總單寧的測(cè)定：采用普魯士蘭法[13]；縮合單寧的測(cè)定：采用香草醛-鹽酸法[14]；還原型VC：采用2,6-二氯靛酚法[15]；黃酮：采用分光光度法[16]；可滴定酸：采用酸堿滴定法[17]；可溶性固形物：用手持測(cè)糖折光儀測(cè)定；SOD：采用鄰苯三酚自氧化速率法[18]；透光率：采用分光光度法，以550nm波長(zhǎng)處的透光率(T)/%值表示，透光率(T)=1/10A，其中A為該波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件，采用Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 單寧酶添加量對(duì)刺梨果汁單寧含量的影響

果蔬中總單寧由水解單寧和縮合單寧兩類組成，水解單寧含量為總單寧含量與縮合單寧含量之差[9]。由圖1可見，單寧酶可以有效地降低刺梨果汁中單寧的含量，隨著單寧酶添加量的增加，單寧含量逐漸下降，其中單寧酶對(duì)總單寧的作用有極顯著性差異(P＜0.01)，而對(duì)縮合單寧的影響效果不明顯(P＞0.05)。當(dāng)單寧酶添加量為0.1g/100mL時(shí)，單寧含量達(dá)到最低值，其中總單寧、縮合單寧含量分別為0.294、0.077g/100mL，脫除率分別為71.54%、22.22%。刺梨果汁中縮合單寧含量較少，因而果汁中單寧主要為水解單寧，水解單寧是由沒食子酸及其衍生物與葡萄糖或多酚通過酯鍵形成的化合物，可與唾液蛋白結(jié)合，使口腔感覺到澀味，且易被氧化產(chǎn)生紅色物質(zhì)[19]，對(duì)果汁產(chǎn)品感官品質(zhì)產(chǎn)生不良影響；而縮合單寧是以黃烷-3-醇為基本單元的縮合物，具有較強(qiáng)的抗氧化性和酶抑制性，還可消除自由基，具有一定的功能特性[20-21]?？梢?，酶法可有效脫除果汁中不利的水解單寧組分，對(duì)縮合單寧影響較小。

圖1 單寧酶添加量對(duì)刺梨汁中單寧含量的影響Fig.1 Effect of tannase dosage on tannin content of R. rose juice

2.1.2 單寧酶作用pH值對(duì)單寧含量的影響

圖2 單寧酶作用pH值對(duì)刺梨汁中單寧含量的影響Fig.2 Effect of reaction pH on tannin content of R. rose juice

由于pH值影響單寧酶的活性，且單寧酶的最適pH值為4.0～6.0[22]，由圖2可知，刺梨汁的pH值對(duì)單寧脫除有很大的影響，刺梨汁單寧含量隨著單寧酶作用pH值的增加呈先減少后增加的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為5時(shí)，單寧酶對(duì)刺梨汁中單寧物質(zhì)的降解效果達(dá)到最佳，但刺梨汁的pH值為4.5，與該最佳值接近，此時(shí)總單寧含量、縮合單寧含量分別為0.290、0.075g/100mL，脫除率分別為69.13%、21.64%。

2.1.3 脫除溫度對(duì)單寧含量的影響

溫度對(duì)單寧酶的活性有影響，且單寧酶的最適溫度為35～60℃[22]，由圖3可知，溫度對(duì)果汁中單寧含量影響很大，隨著單寧酶脫除溫度的升高刺梨汁中單寧含量呈先減少后增加的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，刺梨汁的總單寧、縮合單寧和水解單寧達(dá)到最小值，表明脫除溫度過高或過低均不利于單寧酶脫單寧效果的發(fā)揮，此時(shí)總單寧、縮合單寧含量分別為0.293、0.074g/100mL，脫除率分別72.79%、21.07%。

圖3 單寧酶脫除溫度對(duì)單寧含量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on tannin content of R. rose juice

2.1.4 單寧酶脫除時(shí)間對(duì)單寧含量的影響

圖4 單寧酶脫除時(shí)間對(duì)刺梨汁中單寧含量的影響Fig.4 Effect of reaction time on tannin content of R.. rroossee juiiccee

從圖4可以看出，刺梨汁的單寧含量隨著單寧酶的酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增大，當(dāng)脫除時(shí)間達(dá)到100min時(shí)，刺梨汁中單寧含量達(dá)到最低值，總單寧含量為0.270g/100mL，縮合單寧含量為0.080g/100mL，脫除率分別為74.79%、16.96%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)表對(duì)單寧酶脫除刺梨汁中總單寧的條件進(jìn)一步優(yōu)化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

由表1可看出，A3B1C3D2工藝條件下單寧脫除率最高，極差分析R值可知，影響單寧酶對(duì)總單寧脫除效果的主次因素依次為A＞C＞B＞D，即單寧酶用量對(duì)單寧脫除率影響最大，其次是脫除溫度和果汁pH值，脫除時(shí)間影響最小。從k值分析得每個(gè)因素的各個(gè)水平間大小關(guān)系為A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1，確定各因素的最優(yōu)組合為：A3B1C3D2。分析結(jié)果也顯示，4種因素對(duì)刺梨果汁單寧脫除率的影響趨勢(shì)與單因素試驗(yàn)結(jié)果所示趨勢(shì)相同。

表1 單寧酶脫除刺梨汁中總單寧正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Orthogonal array design and results for the optimization of tannion removal with tannase

表2 方差分析結(jié)果Table2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2方差分析可知，A因素對(duì)指標(biāo)的影響在a=0.05條件下達(dá)到顯著水平，是影響刺梨果汁單寧脫除率的主要因素，而pH值和脫除溫度的影響較小，脫除時(shí)間對(duì)單寧脫除率影響最小，正交試驗(yàn)確定單寧最佳脫除條件為：A3B1C3D2，即單寧酶用量0.12%、酶作用pH4.5、溫度45℃、脫除時(shí)間100min時(shí)，此時(shí)脫除后總單寧含量為0.233g/100mL，脫除率為76.07%。

2.3 不同單寧脫除方法比較

刺梨果汁采用2.2節(jié)條件處理，與采用明膠法(添加量0.5%、靜置時(shí)間100min、pH值3.5、溫度10℃、攪拌時(shí)間7min)和羧甲基殼聚糖法(添加量0.25%、攪拌時(shí)間10min、溫度15℃、pH4、脫除時(shí)間24h)[23]處理的果汁進(jìn)行比較。分析不同單寧脫除法對(duì)刺梨果汁品質(zhì)的影響。

圖5 不同方法的單寧脫除率Fig.5 Removal eff ciencies of tannin with different reagents

由圖5可知，單寧酶對(duì)刺梨果汁總單寧的脫除率高于明膠和羧甲基殼聚糖兩種方法，而縮合單寧的脫除率則較另外兩種方法低，各組處理對(duì)總單寧脫除率無顯著性差異(P＞0.05)，對(duì)縮合單寧有顯著性變化(P＜0.05)。

單寧酶法總單寧脫除率為76.07%，高于明膠和羧甲基殼聚糖方法的56.52%和56.86%，可能由于單寧酶法的脫除屬于酶解過程，具有高效專一的優(yōu)點(diǎn)，能更好地脫除刺梨果汁中單寧成分，對(duì)于縮合單寧的脫除率，單寧酶法的脫除率為25.80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于明膠和羧甲基殼聚糖兩種方法的42.26%和41.33%，可能是因?yàn)榭s合單寧是黃烷-3-醇為基本結(jié)構(gòu)的縮合物，與單寧酶反應(yīng)形成縮合大分子物，在脫除過程中把未脫除的縮合單寧包埋，導(dǎo)致縮合單寧的脫除率較低。

表3 不同脫除方法處理前后刺梨汁中主要成分分析Table3 Major components ofR .. rroossee juice after tannion removal with different reageennttss

由表3可知，經(jīng)單寧酶處理后的刺梨果汁中還原型VC的保存率為72.13%，損失的原因可能是酶解過程中處理溫度及時(shí)間條件導(dǎo)致，在單寧酶處理后能夠較好地保存刺梨汁中黃酮，減少貯藏過程中可滴定酸和可溶性固形物的損失，對(duì)SOD活力的影響不大，黃酮的保存率為96.42%，可滴定酸和可溶性固形物的含量基本穩(wěn)定，這與楊亞力等[24]在滇橄欖果酶法加工中得到的結(jié)果相近。單寧酶對(duì)刺梨汁混濁度沒有明顯影響，而明膠、殼聚糖等是通過吸附沉降來脫除單寧[25]，因而果汁得到沉淀澄清。

3 結(jié)論與討論

單寧酶能較好地脫除刺梨汁中的單寧，最佳脫除條件為單寧酶用量0.12%、pH4.5、脫除溫度45℃、脫除時(shí)間100min，此時(shí)總單寧脫除率為76.07%，這與Srivastava等[12]用單寧酶脫除櫻桃李汁的單寧所得結(jié)果相近；通過單寧酶處理可將容易影響果汁品質(zhì)的水解單寧脫除，對(duì)于具有功能性的縮合單寧則影響較小，且單寧酶法能夠較好地保存刺梨果汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)刺梨果汁組織混濁度沒有顯著影響，能較好保持刺梨原汁的組織形態(tài)，操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單，果汁損失小，可以用于混濁型刺梨汁加工中對(duì)原料的前處理。

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Application of Tannase for the Removal of Tannin from Roxburgh rose Juice

LUO Yu，LIANG Fang，LI Xiao-xin，DING Zhu-hong*
(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province, College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

This paper reports on the application of tannase for the removal of tannion from Roxbugh rose juice. The optimum removal conditions, as determined using one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, were 100 min of treatment at pH 4.5 with an enzyme dosage of 0.12% at 45 ℃. Tannion was successfully removed from Roxbugh rose juice with a removal efficiency of 76.07% under these conditions, while lower removal efficiencies were obtained with treatment with gelatin or carboxymethyl chitosan. The enzymatic treatment had minor effects on nutrients in Roxbugh rose juice but had no obvious impact on the turbidity.

tannase；Roxburgh rose juice；tannin；removal

Q949.751.8

A

1002-6630(2013)18-0041-04

10.7506/spkx1002-6630-201318009

2013-03-01

貴州省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合重大專項(xiàng)字[2013]6006)；畢節(jié)循環(huán)經(jīng)濟(jì)研究院專項(xiàng)資金項(xiàng)目(畢循專合字(2010)ZK008)

羅昱(1990—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：476180108@qq.com

*通信作者：丁筑紅(1966—)，女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工利用。E-mail：gzdxdzh@163.com