王英杰，王文勝，耿淑坤，柴錫慶，3*

（1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院新藥研發(fā)基地，河北石家莊050026）

·論 著·

旋覆花素對(duì)AD模型大鼠腦海馬組織PPARγ表達(dá)的影響

王英杰1，2，王文勝2，耿淑坤1，柴錫慶2，3*

（1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院新藥研發(fā)基地，河北石家莊050026）

目的 觀察旋覆花素對(duì)β淀粉樣蛋白25～35片段（β-Amyloid protein 25-35，Aβ25-35）海馬內(nèi)注射致阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）模型大鼠海馬過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ）表達(dá)的影響，探討其對(duì)AD大鼠的治療作用及機(jī)制。方法30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及旋覆花素給藥組，Aβ25～35海馬內(nèi)注射制備AD大鼠模型，給藥組給予旋覆花素26mg·kg-1·d-1、模型組給予等量溶劑，分2次灌胃，共21d。Western Blot測定大鼠海馬PPARγ表達(dá)。結(jié)果模型組海馬PPARγ表達(dá)下降，給藥組PPARγ表達(dá)升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論旋覆花素通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)，從而抑制Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦海馬腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。

阿爾茨海默??；過氧化物酶體增殖物激活受體；大鼠

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activatived receptors，PPARs）是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族，參與體內(nèi)眾多生理和病理反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如糖代謝、脂肪代謝和細(xì)

胞分化等［1］。PPARs的活性降低與炎癥介質(zhì)的水平上升密切相關(guān)，PPARs的抗炎效應(yīng)在多種炎癥性疾病中有重要作用，對(duì)于多種人體的疾病，以PPAR作為治療靶點(diǎn)可以取得明顯的效果。越來越多的證據(jù)顯示阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）的神經(jīng)毒性由中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥介導(dǎo)［2-3］，PPARγ在腦內(nèi)的表達(dá)與炎癥、神經(jīng)退行性變關(guān)系正在被廣泛研究，研究［4-5］顯示PPARγ基因參與了AD的發(fā)病。本文采用免疫組織化學(xué)及Western Blot方法研究旋覆花素對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、PPARs激活的影響，為探明旋覆花素抑制AD腦炎癥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠30只（由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)611071），鼠齡10～12月齡，體質(zhì)量（364.5±15.0）g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和旋覆花素給藥組，每組10只。給藥組術(shù)前3 d及術(shù)后每天用旋覆花素26mg·kg-1· d-1灌胃，共21d。模型組用旋覆花素的溶劑吐溫80水溶液同法處理。

1.2 試劑與儀器：旋覆花素由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離制備（已獲專利授權(quán)），含旋覆花內(nèi)酯（1-o-acetylbritannilactone，ABL）2.66g/L。β淀粉樣蛋白25～35片段（β-Amyloid protein 25～35，Aβ25～35）購自Sigma公司；PPARγ抗體購自Santa Cruz公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；腦立體定向儀，江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠制造。

1.3 Aβ25～35的孵育：用無菌生理鹽水將Aβ25～35稀釋成10g/L，37℃孵育72h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ25～35，置于在4℃冰箱備用。

1.4 藥物海馬內(nèi)注射方法：大鼠用質(zhì)量濃度為20g/L的烏拉坦60mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜［2］，以前囟為零點(diǎn)，于前囟后3.5mm，中線右側(cè)旁開2mm，為穿刺點(diǎn)，用牙科鉆鉆開顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針3mm，分別于雙側(cè)海馬CA1區(qū)于5min內(nèi)緩慢注射Aβ25～35各1μL（10μg），5min緩慢注入，留針5min，對(duì)照組注射等量生理鹽水，退針縫合切口。術(shù)前3d及術(shù)后18d，給藥組給予旋覆花素26mg·kg-1·d-1分2次灌胃，模型組給予等量溶劑。

1.5 免疫組織化學(xué)染色：參照使用說明書進(jìn)行經(jīng)過乙醇梯度脫水、石蠟垂直包埋，間斷均勻切片，切片厚約10μm，采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合素（strept advin-biotin complex，SABC）方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。以抗PPARγ（1∶100）抗體為一抗，其他操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒作為判定陽性染色的標(biāo)準(zhǔn)。用磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.6 Western Blot分析：各組取等量蛋白提取液80μg，經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroresis，SDS-PAGE）電泳分離后，于半干轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5％脫脂奶粉封閉，與抗PPARγ抗體（1∶300）在4℃條件下反應(yīng)過夜。然后與HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶10 000）室溫反應(yīng)2h，室溫條件下用TTBS、TBS充分振蕩洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法顯影。用美國Kodak公司ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組大鼠腦海馬組織中PPARγ表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，染色細(xì)胞數(shù)量少，著色淺。旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織PPARγ的表達(dá)明顯較模型組增強(qiáng)，染色細(xì)胞數(shù)量多，著色變深（圖1）。

Western Blot顯示，對(duì)照組大鼠腦海馬組織PPARγ表達(dá)量高，模型組海馬組織表達(dá)量顯著降低，旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織PPARγ表達(dá)量明顯上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ表達(dá)免疫組織化學(xué)染色（×400）A.對(duì)照組；B.模型組；C.給藥組

圖2 Western Blot檢測海馬組織PPARγ表達(dá)

3 討 論

PPAR在AD中發(fā)揮多種作用，其中抗炎效應(yīng)是其重要的一方面。Sung等［6］研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ合成配體噻唑烷二酮類藥物（thiazolidinediones，TZDs）2，4-TZD可以減少p65核移位，降低NF-κB的結(jié)合能力，說明PPAR通過抑制NF-κB途徑發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。PPAR激動(dòng)劑可以抑制Aβ25～35介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而阻止皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元死亡，PPARγ激動(dòng)劑可以治療AD、帕金森病等神經(jīng)變性?。?-9］。Sastre等［10］研究表明，與健康人比較AD患者前腦PPAR蛋白水平降低40％，并且與β位點(diǎn)APP內(nèi)切酶1（beta-site amyloid precursor protein cleavage 1，BACE1）啟動(dòng)子的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合能力下降50％，這導(dǎo)致了BACE1的活化，Aβ25～35產(chǎn)生增多，加重AD腦的慢性炎癥。PPARγ已成為合成治療AD藥物的有效靶點(diǎn)。

歐亞旋覆花性味咸、溫，屬菊科旋覆花屬植物，是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有活血化瘀、抗炎止痛之功效。旋覆花素的抗炎機(jī)制與抑制NF-κB活化、下調(diào)其下游基因環(huán)氧化酶2和誘導(dǎo)型一氧化碳合酶表達(dá)有關(guān)。本文中模型組大鼠海馬內(nèi)PPAR基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組，說明Aβ25～35海馬內(nèi)注射可抑制海馬組織PPAR基因的表達(dá)。

給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織內(nèi)PPAR基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明旋覆花素能夠促進(jìn)Aβ海馬內(nèi)注射誘發(fā)的AD模型大鼠PPAR基因的表達(dá)。

綜上所述，旋覆花素能上調(diào)PPAR基因表達(dá)，從而抑制NF-κB表達(dá)，抑制其下游炎癥因子，減輕Aβ25～35海馬內(nèi)注射引起的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元的損傷。

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（本文編輯：趙麗潔）

R743.9

B

1007-3205（2013）07-0802-03

2012-11-08；

2013-03-05

王英杰（1973-）男，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事老年癡呆疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：xqchai@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.021