譚曉秋，程 俊，程秀麗，李 暢，毛 亮，曾曉榮，曹濟(jì)民，楊 艷△

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)電生理省部共建教育部重點實驗室，四川瀘州646000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BKCa）是血管平滑肌重要的鉀離子通道之一，攜帶了70%～80%的外向電流，在調(diào)節(jié)血管張力、血流量和血壓活動中起重要作用。了解作為調(diào)節(jié)血管張力的靶點及內(nèi)源性活性物質(zhì)配體的BKCa通道的特性，對于深入研究通道調(diào)控機制及臨床治療藥物篩選等有重要意義［1-4］。BKCa通道受細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度和膜電位二者的調(diào)節(jié)［5］。當(dāng)肌緊張性增高時，Ca2＋內(nèi)流激活肌漿網(wǎng)釋放細(xì)胞內(nèi)鈣，再加上膜的去極化共同激活BKCa通道，使K＋外流，膜電位向超極化方向變化而使血管舒張，從而對抗張力增高引起的去極化及收縮作用，使細(xì)胞恢復(fù)到下一次興奮前的備用狀態(tài)。BKCa通道就是通過環(huán)形負(fù)反饋機制來控制平滑肌細(xì)胞肌源性張力和靜息膜電位去極化的程度。而BKCa通道的高電導(dǎo)性及在平滑肌細(xì)胞上的高密度表達(dá)決定了它對血管張力的調(diào)節(jié)尤顯重要［6-9］。目前對于BKCa通道的研究更是深入基因和分析水平，而離子通道藥物作用的動力學(xué)調(diào)控更是研究的熱點之一［4，6］。但是天然細(xì)胞由于通道不單一、表達(dá)密度不確定等特點，在研究動力學(xué)調(diào)控方面，異源表達(dá)越來越受人們青睞。本研究以HEK293細(xì)胞系為載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人BKCa通道細(xì)胞系，研究其基本電生理學(xué)特征和建立動力學(xué)調(diào)控模型，為進(jìn)一步廣泛深入的研究藥物動力學(xué)作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 含有人血管平滑肌BKCa通道α亞單位的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKα由丹麥NeuroSearch公司Philip K.Ahring教授饋贈，β1亞單位的表達(dá)質(zhì)粒pIRES-β1由本實驗室構(gòu)建。改良Eagle高糖培養(yǎng)基（DMEM）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染和篩選 HEK293細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）在5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞密度80%左右使用脂質(zhì)體（lipofectamine 2000，Invitrogen）轉(zhuǎn)染法，將4μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到3.5mm的培養(yǎng)皿中。使用0.8mg／mL G418進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-BKα和（或）β1的 HEK293細(xì)胞系用于進(jìn)一步實驗。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗實驗 選取電極阻抗3～5mΩ進(jìn)行。浴液為：NaCl 137.00mmol／L，KCl 5.90mmol／L，MgCl21.20 mmol／L，CaCl21.8mmol／L，葡萄糖 14.00mmol／L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10.00mmol／L（pH 7.4）；電極液：KCl 128.00mmol／L，NaCl 12.00mmol／L，MgCl24.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L，乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）0.05mmol／L（pH 7.2）。鉗制電位為-80mV，刺激方案包括階躍刺激方案：-80mV～＋90mV，時程400ms。

1.2.3 單通道膜片鉗實驗 本實驗采用的單通道膜片鉗記錄方式包括細(xì)胞貼附式、內(nèi)面向外式和外面向外式，浴液和電極液使用對稱性高鉀溶液，電極阻抗12～15mΩ。電極液和浴液根據(jù)細(xì)胞膜的方式選擇，保持細(xì)胞內(nèi)液：天門冬氨酸鉀（KAsp）100.00mmol／L，KCl 40.00mmol／L，HEPES 10.00／L mmol（pH 7.2），EGTA 1.00mmol／L；細(xì) 胞 外 液：K-Asp 40.00mmol／L，KCl 100.00mmol／L，HEPES-K 10.00mmol／L （pH 7.4），EGTA 2.00mmol／L。

1.2.4 內(nèi)面向外式宏觀電流（macro-insideout）檢測 選擇離子通道表達(dá)密度較高的細(xì)胞，使用電極阻抗為3～5mΩ，形成內(nèi)面向外式膜片，使用宏觀電流記錄方案，觀察局部膜片電流，研究其動力學(xué)調(diào)控。電極液：K-Asp 40.00mmol／L，KCl 100.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L （pH 7.2），EGTA 2.00mmol／L；浴液：K-Asp 100.00mmol／L，KCl 40.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L （pH 7.4），EGTA 1.00mmol／L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用Clampfit10.1進(jìn)行處理。計量資料采用±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HEK293細(xì)胞上BKCa的基本電生理學(xué)特性 轉(zhuǎn)染在HEK293細(xì)胞系的BKCa電流基本電生理學(xué)特性，全細(xì)胞構(gòu)型下，轉(zhuǎn)染BKCa通道α亞單位的HEK293細(xì)胞能夠記錄到一較大外向電流，I-V曲線呈現(xiàn)外向整流特性，能夠被BKCa特異性阻斷劑IbTX（200nmol／L）所阻斷（圖1），表明所記錄到的外向電流主要為BKCa所攜帶。在單通道構(gòu)型下，細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式均能記錄到電流幅度隨著電壓增加而增大的單通道電流，開放概率呈現(xiàn)明顯的電壓依賴性。在cell-attached和inside-out構(gòu)型下，BKCa通道具有明顯的電壓依賴性（圖2）；cell-attached和inside-out BKCa單通道斜率電導(dǎo)分別為（212.64±4.86）pS（n＝12）和（216.38±3.55）pS（n＝10），二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）；在inside-out構(gòu)型下（＋40mV膜電位）BKCa通道鈣離子依賴性的典型電流記錄圖，見圖4；BKCa通道IbTX敏感性，在outside-out構(gòu)型下，BKCa通道能夠被200nmol／L IbTX阻斷（圖5）。在外面向外式膜片構(gòu)型下，200nmol／L IbTX幾乎完全阻斷該單通道電流，進(jìn)一步證明該電流為BKCa電流。同時，通過圖3的I-V曲線可以看，I-V曲線通過0點，反轉(zhuǎn)電位為0mV，這與對稱性高鉀時的平衡電位一致，表明為鉀離子選擇性電流。

圖1 表達(dá)在HEK 293細(xì)胞系上的BK通道全細(xì)胞電流

圖2 BKCa通道電壓依賴性電流圖

圖3 BKCa單通道斜率電導(dǎo)比較電流圖

圖4 BKCa通道鈣離子依賴性的典型電流圖

圖5 BKCa通道被bTX阻斷電流圖

2.2 HEK293細(xì)胞上BKCa動力學(xué)調(diào)控模型研究 本研究采用兩種方式研究BKCa動力學(xué)調(diào)控模型（圖6），一種為內(nèi)面向外式單通道膜片鉗，一種為內(nèi)面向外式宏觀電流（圖6A）。在內(nèi)面向外式單通道下，共轉(zhuǎn)染BKCa通道α和（或）β1亞單位發(fā)現(xiàn)，β1的表達(dá)一方面增加了通道的開放該概率，另一方面可以明顯增加通道的開放時程（即平均開放時間，見圖6A彩色）。通過增加通道表達(dá)密度，使用內(nèi)面向外式宏觀電流記錄方式研究通道電壓依賴性、Ca2＋敏感性和通道動力學(xué)。在內(nèi)外向外式宏觀電流記錄中可以分析通道從關(guān)閉向開放（C→O）和開放向關(guān)閉（O→C）之間轉(zhuǎn)變的動力學(xué)特征（圖6B）。從-80mV去極化到＋150mV通道完全開放，通過擬合得到時間常數(shù)為Tau＝1.76ms，而當(dāng)通道由＋150mV超極化到-80mV時，通道關(guān)閉。在此過程中產(chǎn)生尾電流，可以反映通道從開放向關(guān)閉轉(zhuǎn)換的過程，通過擬合得到本例的時間常數(shù)Tau＝0.27ms。通過在階躍（step）刺激方案得到的內(nèi)面向外式宏觀電流（圖6C），隨著去極化電壓的增加，電流幅度增加。計算得到不同電壓下的電導(dǎo)值（G），以G／Gmax-Vm作圖，曲線經(jīng)Boltzmann方程擬合，得到通道的半數(shù)最大激活電壓（V1／2），本實驗在細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度（［Ca2＋］free）為 0.01μmol／L 的是 V1／2為（86.0±9.9）mV，見圖6D。

圖6 表達(dá)在HEK293細(xì)胞系上的BKCa通道動力學(xué)特性

3 討 論

3.1 BKCa通道在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 作為血管平滑肌細(xì)胞膜上表達(dá)最為豐富的BKCa通道，一直以來是從事血管活動調(diào)控研究的熱點和重點。BKCa通道是很多臨床降血壓藥物中的作用靶點之一，包括一些常見的活血化淤中藥也可以通過激活該通道而發(fā)揮調(diào)控血壓的作用［10-13］。隨著研究的深入，僅僅利用急性酶分離的細(xì)胞從事BKCa通道調(diào)控研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，尤其是血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)之后常常發(fā)生表型的改變，BKCa通道的表達(dá)和功能也發(fā)生變化。因此，將通道克隆到工具細(xì)胞進(jìn)行研究是常見的研究方法之一。尤其是一些針對BKCa通道功能結(jié)構(gòu)域和位點突變以及動力學(xué)研究。本實驗通過構(gòu)建和篩選穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株并通過電生理學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。表達(dá)在HEK293細(xì)胞上BKCa通道電生理學(xué)特性與文獻(xiàn)和本研究報道的急性酶分離天然細(xì)胞是一致的，主要包括大電導(dǎo)特性［本實驗內(nèi)面向外式構(gòu)型下的電導(dǎo)值為（216.38±3.55）pS］、電壓依賴性、Ca2＋敏感性和IbTX敏感性。通過多種技術(shù)和手段證明本實驗構(gòu)建的細(xì)胞株能夠很好的用于BKCa通道功能調(diào)控研究。

3.2 BKCa通道動力學(xué)調(diào)控 目前，對于BKCa通道的功能調(diào)控研究已比較的深入，但是從文獻(xiàn)報道看不同藥物表現(xiàn)出不同的作用特點，主要表現(xiàn)在動力學(xué)的差異［12］。所謂的通道動力學(xué)主要是指通道開放和關(guān)閉狀態(tài)相互轉(zhuǎn)變過程中的機制。這是一個非常復(fù)雜的過程。膜片鉗技術(shù)是研究離子通道動力學(xué)調(diào)控的最有效的技術(shù)，一方面可以通過單通道記錄技術(shù)研究某一單個的離子通道的開放和關(guān)閉的動力學(xué)特點（圖6A），另一方面也可通過全細(xì)胞記錄研究整個細(xì)胞的離子通道宏觀動力學(xué)，二者互為補充。BKCa通道由α和β1亞單位組成，β1亞單位是通道發(fā)揮正常功能的組成部分，研究表明β1亞單位的功能異常與高血壓的發(fā)生存在密切關(guān)系［14-15］。本課題前期研究提示，在高血壓患者存在β1亞單位水平的下調(diào)［16］。本研究通過共表達(dá)α和β1亞單位可以看出，β1亞單位通過增加通道的開放時程而使通道的開放增加。另外，由于很多物質(zhì)對BKCa通道的作用位點是在細(xì)胞內(nèi)（如Ca2＋），因此單通道記錄上多采用內(nèi)面向外式膜片鉗。由于傳統(tǒng)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)胞內(nèi)換液非常困難而且穩(wěn)定性較差，因而全細(xì)胞膜片鉗在研究BKCa通道胞內(nèi)作用物質(zhì)動力學(xué)機制上表現(xiàn)出一定的不足之處。本實驗通過增加BKCa通道在HEK293細(xì)胞上的表達(dá)密度，同時實驗過程中增大記錄電極的口徑（本實驗為3～5mΩ，而不是常用的單通道阻抗12～15mΩ），這樣在一個膜片上就有幾十或者上百個離子通道表達(dá)，從而記錄到與全細(xì)胞類似的電流，稱之為macro-insideout current（圖6C）。在此基礎(chǔ)上，可以很方便地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)作用研究，比如改變不同的鈣離子濃度。該記錄方式還有一個有單通道記錄相同的優(yōu)點就是記錄更加穩(wěn)定，對防震的要求比傳統(tǒng)全細(xì)胞低。因此，該記錄方式可以很好的研究通道的開關(guān)動力學(xué)、電壓依賴性和鈣離子敏感性。但是，該記錄方式適用于一些直接作用于通道內(nèi)側(cè)的物質(zhì)進(jìn)行研究，而對于直接細(xì)胞外作用或者與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而間接作用于通道的物質(zhì)不適宜選用此種方法。

綜上所述，本實驗構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)BKCa通道的HEK293細(xì)胞系及在此基礎(chǔ)上建立的動力學(xué)模型可以很好的用于部分BKCa通道功能研究。

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