戴 斌，崔 猛，張 宏

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300052；2.天津醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，天津300211；3.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院肥胖代謝科，天津300070）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是一種獨(dú)立的、特異的糖尿病并發(fā)癥，與繼發(fā)于高血壓、冠心病或瓣膜性心臟病的病理、生理改變不完全相同。DC是由糖代謝紊亂引起的心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷及心肌功能障礙，其臨床特征主要以左心室肥厚及心肌舒縮功能缺損為主，隨著病程的進(jìn)展會出現(xiàn)充血性心力衰竭，是糖尿病患者致殘和致死的重要原因之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者多表現(xiàn)為向心性心室肥厚，可伴有左心室功能受損，心臟順應(yīng)性下降。除心肌細(xì)胞肥大外，心肌纖維化及間質(zhì)重構(gòu)亦是DC時(shí)心室舒縮功能障礙、心力衰竭的主要機(jī)制之一［1］。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～3d的SD幼鼠15只，平均體質(zhì)量8.5g，購自天津醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。DMEM培養(yǎng)基購于美國Sigma公司。胎牛血清購于英國Gibco公司，胰蛋白酶購于美國Sigma公司，Vimentin波形蛋白單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。Ⅰ型前膠原羧基端肽（PⅠCP）與Ⅲ型前膠原氨基端肽（PⅢNP）ELISA試劑盒購于美國BPB公司。Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，定量PCR相關(guān)試劑購于日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將幼鼠處死后剪取心尖組織。DMEM洗，剪碎，Ⅱ型前膠元酶消化后收集上清液。加入10%胎牛血清，離心重懸細(xì)胞，于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)2h，吸去上清液，重新加入培養(yǎng)液，原代培養(yǎng)細(xì)胞生長成細(xì)胞單層。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1∶2比例傳代培養(yǎng)。經(jīng)3次傳代后，已純化為心肌成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)選用3～5代細(xì)胞。行抗波形蛋白多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定，結(jié)果為陽性。

1.2.2 試驗(yàn)分組 所有細(xì)胞共分成2組。（1）高糖組：高糖培養(yǎng)定義為DMEM25培養(yǎng)基中含葡萄糖25mmol／L；（2）對照組：正常糖DMEM5.5培養(yǎng)基含葡萄糖5.5mmol／L。各組細(xì)胞均刺激6、12、24h后，棄去培養(yǎng)液，加Trizol、氯仿，離心收集細(xì)胞沉淀。抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測6、12、24h各組細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原的mRNA表達(dá) Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增各組細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原的mRNA，內(nèi)參使用 GAPDH。α1（Ⅰ型）前膠原擴(kuò)增的上游引物：5′－AGC CAC CAG CCC CTC ACT－3′；下游引物 5′－CGA GGT AGT CTT TCA GCA ACA CAG T－3′；擴(kuò)增片斷長度為160bp。α1（Ⅲ型）前膠原上游引物：5′－CAA CAC CGA TGA GAT TAT G－3′；下游引物：5′－TCA GGA TTG CCG TAG C－3′；擴(kuò)增片斷長度為344bp。GAPDH 上游引物：5′－GGG GTG ATG CTG GTG CTG AG－3′，下游引物5′－GAT GCA GGG ATG ATG TTC TG－3′擴(kuò)增片段370bp。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄65℃10 min，25℃5min；預(yù)變性94℃4min；循環(huán)94℃30s：50℃退火30s：72℃延伸40s；共40個循環(huán)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測各組細(xì)胞24、48、72h 3個時(shí)間點(diǎn)的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) Ⅰ與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)由PⅠCP與PⅢNP決定，根據(jù)ELISA試劑盒說明操作以檢測PⅠCP與PⅢCP的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果取均值，計(jì)量資料以±s表示。各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)比較 與對照組比較，高糖組細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)后Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)顯著上升，呈時(shí)間依賴性，培養(yǎng)12h后升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24h達(dá)高峰；Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)在24h升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在48h升高達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在72h有所降低，與對照組比較升高仍差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 兩組細(xì)胞Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)比較

圖2 兩組細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)比較

2.2 兩組細(xì)胞Ⅲ型膠原表達(dá)比較 與對照組比較，高糖組細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)后Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性上升，12h升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24h升高達(dá)高峰（圖3）。高糖刺激膠原的mRNA表達(dá)升高，Ⅰ型膠原mRNA升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。與對照組比較，高糖組Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上升，24h升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48h明顯升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），72h達(dá)高峰（圖4）。與對照組比較，48h時(shí)Ⅰ型膠原蛋白升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。

圖3 兩組細(xì)胞Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)比較

圖4 兩組細(xì)胞Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)比較

3 討 論

糖尿病是一種威脅全人類健康的疾病，發(fā)病率逐年增加。而糖尿病目前已被視為冠心病的等危癥，因?yàn)樘悄虿★@著升高心血管疾病的發(fā)病率和死亡率。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者并發(fā)冠心病是非糖尿病患者的4倍。然而，糖尿病導(dǎo)致冠心病的發(fā)生是多因素、多途徑的，其具體機(jī)制目前尚未完全明確。糖尿病動物模型和臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心臟心肌細(xì)胞顯著肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增加、心臟纖維化和舒縮功能減退，導(dǎo)致心室壁僵硬度增加，呈現(xiàn)類似限制性心肌病樣的改變［2－5］。

心肌成纖維細(xì)胞是心臟組織中數(shù)目最多的細(xì)胞，遍布于心肌組織，包繞心肌細(xì)胞并連接細(xì)胞間質(zhì)［6－7］。心肌成纖維細(xì)胞是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其過度增殖，膠原分泌增加在心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。高血糖是導(dǎo)致心肌纖維化及間質(zhì)重構(gòu)的重要因素，有研究表明，糖基化終末產(chǎn)物可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖［8－9］。高血糖可通過多種途徑促使心臟纖維化［10－12］，其機(jī)制包括暫時(shí)或持續(xù)的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和增加成纖維細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。其信號調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜。深入探索高糖誘導(dǎo)心肌纖維化的分子機(jī)制對防治糖尿病心肌病的進(jìn)行性發(fā)展具有重要意義。

心肌成纖維細(xì)胞是心臟分泌膠原的主要細(xì)胞，是維持心臟生理和病理性重塑的主要調(diào)節(jié)因素［13－15］。本實(shí)驗(yàn)觀察到高糖培養(yǎng)鼠心肌成纖維細(xì)胞，可促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升，表明心肌成纖維細(xì)胞的膠原合成在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平進(jìn)行。高糖刺激鼠心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖并呈時(shí)間依賴性，培養(yǎng)12hmRNA即升高，而蛋白在48h明顯升高，蛋白延后于mRNA水平的升高表明了反應(yīng)的連續(xù)性和順序性。高糖刺激膠原mRNA表達(dá)升高，Ⅰ型膠原mRNA升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上升，24h升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48h明顯升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），72h達(dá)高峰。48h時(shí)Ⅰ型膠原蛋白升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。

高糖促進(jìn)膠原合成，從而促進(jìn)纖維化。本研究證實(shí)高糖可以促進(jìn)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖，Ⅰ、Ⅲ膠原mRNA及蛋白表達(dá)增多，Ⅰ型膠原升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。其具體上下游信號通路有待進(jìn)一步研究。

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