李學慧，代麗麗，董 玫，張 霞，謝 磊，張紅真△

（河北醫(yī)科大學：1.第一醫(yī)院婦產(chǎn)科；2.基礎醫(yī)學院，河北石家莊050011）

目前化療已成為治療中、晚期惡性腫瘤的重要方法，但是現(xiàn)有的絕大多數(shù)化療藥物細胞毒作用大、組織特異性差，易產(chǎn)生耐藥性等問題一直困擾著臨床醫(yī)生。因此，尋找毒副作用低，抗耐藥性強，組織特異性強的化療藥物已成為國內、外研究的熱點之一。自天然產(chǎn)物紫杉醇作為抗癌藥物應用到臨床以來，與其結構相似藥物的開發(fā)已愈來愈受到重視。有研究報道，日本粗榧果實中分離出的二萜類化合物kayadiol對人白血病細胞K562細胞增殖有抑制作用［1－2］。目前對二萜類化合物的抑瘤活性的研究比較少見，關于kayadiol抑制細胞增殖作用機制的研究更少見報道。本研究將二萜類化合物kayadiol作用于人子宮內膜癌HEC－1細胞株，觀測其對子宮內膜癌細胞的生物學影響，并探討其內在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內膜癌細胞株HEC－1由日本千葉大學醫(yī)學部第二生物化學教室提供。實驗用化合物kayadiol由河北醫(yī)科大學藥學院天然藥物化學教研室提供。四甲基偶氮唑鹽（MTT）和順鉑（cisplatin）購自美國Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（11684795910）購自德國Roche公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國Biotec公司；鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）多克隆抗體、鼠抗人 Bax多克隆抗 體 （sc－7480）、羊抗鼠IgG紅外熒光二抗及β－actin購自美國Santa Cruz公司；溴化乙錠購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 體外抑瘤實驗 取對數(shù)生長期HEC－1細胞，調整細胞濃度為1×105／mL，接種于96孔板，每孔100mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸出各孔內培養(yǎng)基，加入含有不同濃度kayadiol（1、10、100、μmol／L）的培養(yǎng)基，并設二甲基亞砜（DMSO）溶劑對照組（1、10、100μmol／L的 DMSO）、順鉑對照組（分別為1、10、100μmol／L的順鉑），每孔100μL，每組設3個復孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h后，向各培養(yǎng)孔中加入10mL MTT（5mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，充分溶解藍紫色結晶。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）于492nm波長下測定各孔OD值，計算藥物對細胞的抑制率。生存率（%）＝（實驗組OD值／對照組OD值）×100%。

1.2.2 凋亡細胞原位標記與半定量分析 取對數(shù)生長期的HEC－1細胞，接種于8孔培養(yǎng)板，每孔100μL（含1×104個細胞），分別加入終濃度0.1%DMSO和終濃度為10μmol／L的kayadiol 100μL，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24h；棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，每孔100μL，于室溫培養(yǎng)1h；棄液體，加入通透液每孔100μL，冰浴2min；棄液體，溶劑對照組與kayadiol組加入TUNEL溶液，每孔80μL。溶劑對照組，加入熒光標記的三磷酸脫氧尿苷（dUTP）液，每孔80μL，加蓋玻片在暗濕盒中反應1h。棄液體，熒光顯微鏡下觀察，可以使用的激發(fā)波長范圍為450～500nm，發(fā)射波長范圍為515～565nm（綠色熒光）。結果根據(jù)凋亡陽性細胞分布情況。每張切片拍攝5個陽性視野，每視野計數(shù)正常細胞數(shù)和帶熒光的凋亡細胞數(shù)，以陽性細胞所占正常細胞的百分比作為細胞凋亡率（AR）。

1.2.3 Western blot法檢測 收集溶劑對照組、順鉑對照組（終濃度為10μmol／L的順鉑作用48h）和kayadiol組（終濃度為10μmol／L kayadiol作用48h）HEC－1細胞，按蛋白提取操作步驟提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）2h，然后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，用含脫脂奶粉的無蛋白（TBS）封閉緩沖液封閉1h后，分別加入一抗Bax抗體（1∶500）和Caspase－3抗體（1∶700），4℃過夜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1h，雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描顯像，設β－Actin為內參。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。實驗結果以±s表示，兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗。多組間比較用方差分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Kayadiol、順鉑對HEC－1細胞增殖的影響 Kayadiol和順鉑對 HEC－1細胞的增殖顯示強的抑制活性。1、10、100 μmol／L的順鉑處理HEC－1細胞后，其生存率分別為86.04%、66.33%、37.04%，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關系，與溶劑對照組比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；kayadiol組1、10、100 μmol／L kayadiol處 理 HEC－1 細 胞 后，其 生 存 率 分 別 為69.87%、39.31%、2.76%，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關系，與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。順鉑和kayadiol作用后HEC－1細胞生存率比較，見表1。

表1 順鉑和kayadiol作用后HEC－1細胞生存率比較（%）

圖1 各組HEC－1細胞凋亡情況

2.2 Kayadiol對 HEC－1細胞凋亡的影響 10μmol／L的kayadiol處理HEC－1細胞24h后，TUNEL法檢測結果顯示，Kayadiol可明顯誘導HEC－1細胞的凋亡，具有時間依賴關系，溶劑對照組和Kayadiol組12、24h的 HEC－1細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。熒光顯微鏡下觀察各組HEC－1細胞凋亡情況，見圖1。

2.3 Kayadiol對HEC－1細胞中Bax和Caspase－3蛋白表達的影響 Western blot結果提示，經(jīng)kayadiol處理48h后的HEC－1細胞內的Bax、caspase－3蛋白表達水平顯著上調，與順鉑對照組接近，見圖2。

表2 溶劑對照組和Kayadiol組12、24h的HEC－1細胞凋亡率比較（±s）

表2 溶劑對照組和Kayadiol組12、24h的HEC－1細胞凋亡率比較（±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與溶劑對照組比較。

組別2.40±1.20 3.06±0.27 Kayadiol組 40.16±6.84＊ 86.88±6.00 12h 24h溶劑對照組＊＊

圖2 各組HEC－1細胞48h后Bax、Caspase－3蛋白表達

3 討 論

子宮內膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。子宮內膜癌的治療以手術為主，放療為輔，化療主要用于特殊病理類型、細胞分化差或晚期的和復發(fā)的子宮內膜癌，旨在降低內膜癌的復發(fā)風險［3－4］，提高總體生存率。近年來，具有高危因素的子宮內膜癌術后同步放、化療也開始應用［5－7］，同時，國外開展了多項針對早期高危子宮內膜癌術后輔助化療預防復發(fā)的隨機對照研究，使早期子宮內膜癌化療成為目前研究的熱點之一。

二萜類化合物中紫杉醇、雷公藤內酯醇等對多種腫瘤細胞的增殖都有抑制作用［8－11］。kayadiol是從日本榧樹中分離出的二萜類化合物，潘永梅等［1］報道kayadiol對人白血病細胞K562細胞增殖也有抑制活性。順鉑是廣譜抗癌藥，為鉑的金屬絡合物，作用似烷化劑，主要作用靶點為DNA，是被證明在鉑類藥物中最有效的藥物。本實驗以kayadiol為研究對象，以順鉑為陽性對照，用MTT比色法檢測其對人子宮內膜癌HEC－1細胞株體外生長的抑制作用，結果顯示經(jīng)1、10、100 μmol／L 3種不同濃度的kayadiol作用 HEC－1細胞后，HEC－1細胞株生存率與溶劑對照組比較均差異有統(tǒng)計學意義，且呈現(xiàn)劑量依賴關系，以濃度100μmol／L顯著（P＜0.01），強于順鉑抑瘤效果。

細胞增殖與凋亡平衡的失調和多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系［12－14］。凋亡抑制基因過高表達、促凋亡基因突變或缺失，都可使腫瘤發(fā)生率增加［15］。本實驗用TUNEL法檢測了kayadiol處理12、24h后HEC－1細胞的細胞凋亡率，結果顯示差異有統(tǒng)計學意義，且具有時間依賴關系，提示kayadiol具有明顯誘導HEC－1細胞發(fā)生凋亡的活性。Bax蛋白是Bcl－2家族的一種前凋亡蛋白，主要定位于細胞質，一旦受到凋亡因子的誘導，可以向線粒體轉位，通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或者開啟線粒體的通透性轉換孔，導致線粒體中的凋亡因子釋放，從而激活Caspase蛋白導致細胞凋亡。Caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶［16］，其中Caspase－3可直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白而引起細胞凋亡。本實驗用Western blot法檢測kayadiol處理48h后的HEC－1細胞中的Caspase－3和Bax蛋白水平，結果顯示：經(jīng)kayadiol處理后，HEC－1細胞內的Caspase－3和Bax蛋白表達明顯上調，提示kayadiol對人子宮內膜癌細胞增殖的抑制作用有可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)的。

綜上所述，本實驗證實kayadiol對HEC－1細胞的增殖具有強的抑制作用，呈時效和量效關系，其抑制HEC－1細胞增殖是通過上調Bax蛋白的表達和激活Caspase－3而引起腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。誘導細胞凋亡是一個由多信號誘導、多基因調控和多因子參與的過程，本實驗驗證的僅僅是誘導凋亡的通路之一，kayadiol是否還通過其他途徑誘導凋亡需要進一步研究。

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