王 娣，許 暉，錢時(shí)權(quán)，曹珂珂，任茂生，田長城

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

麝香草酚對食品常見污染菌的抑菌作用

王 娣，許 暉，錢時(shí)權(quán)，曹珂珂，任茂生，田長城

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

為闡明麝香草酚的抑菌作用，采用濾紙片法、牛津杯法和擴(kuò)散法(打孔法)等體外抑菌實(shí)驗(yàn)對食品中常見的10種污染菌進(jìn)行抑菌作用研究，并測定麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、異常漢遜氏酵母、釀酒酵母、黑曲霉、黃曲霉的最低抑菌質(zhì)量濃度。結(jié)果表明：麝香草酚抑菌譜廣，對食品中常見污染菌有一定抑制作用，其中對細(xì)菌的抑菌效果最好。麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為10、20、20μg/mL。

麝香草酚；抑菌作用；濾紙片法；牛津杯法；擴(kuò)散法

麝香草酚(thymol)，別名麝香草腦、百里酚，片狀結(jié)晶，極易溶于乙醇、乙醚、醋酸、氯仿和苯中。天然存在于唇形科植物百里香屬植物中，有百里香屬植物的辛香和草香香氣，是植物揮發(fā)油的主要成分(含50%左右)[1-2]，可用酚鈉鹽法從植物揮發(fā)油中單離出來，再經(jīng)干燥、減壓蒸餾即得產(chǎn)品。百里香屬植物是一種頗具開發(fā)價(jià)值的多用途植物，可以作為天然調(diào)味品、藥用植物和蜜源植物等[3-5]。我國主要分布于甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)[6]。國內(nèi)外學(xué)者對麝香草酚活性進(jìn)行了不少研究。Chu等[7]用質(zhì)量濃度30mg/L蒸汽麝香草酚對甜櫻桃進(jìn)行熏蒸處理，可以有效抑制灰霉病和褐腐病，貯藏期間處理的甜櫻桃只有0.5%的灰霉病。Liu Weitang等[8]研究表明用2～4mg/L質(zhì)量濃度的麝香草酚對杏和李熏蒸處理可顯著降低爛果率，而且對水果組織不產(chǎn)生任何影響。這說明麝香草酚具有一定抑菌防腐活性。本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法、牛津杯法以及擴(kuò)散法研究麝香草酚對食品中常見污染菌的抑制作用，為麝香草酚作為食品防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌株

1.1.1 麝香草酚

麝香草酚(C10H14O，含量＞98%，分析純) 天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 供試菌種

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GIM 1.55、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GIM 1.131、大腸桿菌(Escherichia coli)GIM 1.154、變形桿菌(Proteus vulgaris)GIM 1.192、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM 1.189、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophilus)GIM 1.83；酵母：異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)GIM 2.18、釀酒酵母(Saccharmucescerevisiae)GIM 2.34、霉菌：黑曲霉(Aspergillus niger)GIM 3.24；黃曲霉(Aspergillus fl avus)GIM 3.18；以上菌種購于廣州微生物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BPA)：培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BPA)；變形桿菌(Proteus vulgaris)用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(BPAE)，添加95%的酒精5mL/100mL。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS瓊脂培養(yǎng)基)：培養(yǎng)保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophilus)采用MRS瓊脂培養(yǎng)基。

馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：培養(yǎng)異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)、釀酒酵母(Sacchromuces cerevislac)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus fl avus)采用馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

LRH-150-Ⅱ智能生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-40BI高壓滅菌鍋 北京京儀東方科技有限公司；LX41多功能顯微鏡上海富眾生物科學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的準(zhǔn)備

將供試菌種劃線接入相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，酵母于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，4℃冰箱中冷藏備用。

供試菌株菌懸浮液的制備：分別用接種環(huán)挑取少許細(xì)菌、酵母菌和霉菌孢子于裝有玻璃珠和10mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩，采用活菌計(jì)數(shù)法測定菌數(shù)[9]，制成菌體或孢子濃度為106～107CFU/mL的均勻菌懸浮液或孢子懸液。

1.2.2 濾紙片法測定抑菌效果

不同質(zhì)量濃度的麝香草酚配制：麝香草酚加少許吐溫-80增溶[10]，再加適量無菌水超聲乳化、定容，配制成500、800、1000μg/mL不同質(zhì)量濃度(吐溫-80含量不超過0.5%)。以0.5%的吐溫-80作為對照。

根據(jù)王忠民等[11]方法并加以改進(jìn)。取滅菌后的濾紙圓片(d=6mm)，分別置于不同質(zhì)量濃度的麝香草酚中浸泡10min，瀝去多余液體，置于已用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中，每個(gè)菌種做3次平行。細(xì)菌恒溫培養(yǎng)24h，酵母培養(yǎng)48h，霉菌培養(yǎng)5d，觀察有無抑菌作用。

1.2.3 牛津杯法測定抑菌效果

根據(jù)武忠偉等[12]實(shí)驗(yàn)方法并加以改進(jìn)。取滅菌烘干的牛津杯(外徑8mm、內(nèi)徑6mm、高10mm)置于已用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中，用無菌微量移液器分別注入200μL不同質(zhì)量濃度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每種菌做3個(gè)平行。培養(yǎng)溫度和時(shí)間同1.2.2節(jié)，觀察有無抑菌作用。

1.2.4 擴(kuò)散法(打孔法)測定抑菌效果

根據(jù)李建慧等[13]方法并加以改進(jìn)。用滅過菌的打孔器(孔徑6mm)在用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中十字對稱打4個(gè)孔，用無菌微量移液器分別加入100μL不同質(zhì)量濃度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每種菌做3個(gè)平行。培養(yǎng)溫度和時(shí)間同1.2.2節(jié)，觀察有無抑菌作用。

重復(fù)驗(yàn)證檢驗(yàn)：在定性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對麝香草酚敏感的3種細(xì)菌(金黃色葡萄球菌S. aureus、枯草芽孢桿菌B. subtilis、大腸桿菌E. coli)做重復(fù)驗(yàn)證檢驗(yàn)，觀測其抑菌圈直徑大小，以0.1%的苯甲酸鈉作為陽性對照。

1.2.5 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定[13]

用滅過菌的打孔器(孔徑6mm)在培養(yǎng)皿(0.1mL菌懸液涂布均勻)中十字對稱打4個(gè)孔，分別加入2.5～320μg/mL系列質(zhì)量濃度的麝香草酚100μL，以0.5%的吐溫-80作為對照，培養(yǎng)、觀察，得到最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法測定抑菌結(jié)果由表1、圖1可知，麝香草酚對這10種食品中常見污染菌都有一定抑制作用。隨著麝香草酚質(zhì)量濃度的增加，抑菌作用在不斷增強(qiáng)。麝香草酚質(zhì)量濃度為1000μg/mL時(shí)，對細(xì)菌中的大腸桿菌抑菌作用最明顯，其次是金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；對酵母菌中的釀酒酵母抑菌作用要大于異常漢遜氏酵母；對霉菌中的黑曲霉抑菌作用稍強(qiáng)一些。

表1 濾紙片法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌效果Table1 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

圖1 濾紙片法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig.1 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

2.2 牛津杯法抑菌測定結(jié)果

表2 牛津杯法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌效果Table2 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

圖2 牛津杯法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig.2 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

由表2、圖2可知，隨著麝香草酚質(zhì)量濃度的增加，抑菌作用不斷增強(qiáng)。麝香草酚質(zhì)量濃度為1000μg/mL時(shí)，測定的抑菌圈直徑大小次序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞保加利亞乳桿菌＞變形桿菌＞釀酒酵母＞異常漢遜氏酵母＞嗜熱乳酸鏈球菌＞黑曲霉＞黃曲霉。與濾紙片法相比抑菌結(jié)果之所以有差別，可能是每次加入的菌懸液濃度有誤差，或者實(shí)驗(yàn)操作有誤差所致。

2.3 擴(kuò)散法(打孔法)測定抑菌結(jié)果

由表3、4及圖3可知，麝香草酚對細(xì)菌、酵母和霉菌均有較強(qiáng)的抑制作用，是一種廣譜性抑菌劑。其中對細(xì)菌的抑制作用要強(qiáng)于酵母菌和霉菌，尤其對細(xì)菌中的金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)。麝香草酚質(zhì)量濃度為1000μg/mL的抑菌能力比0.1%苯甲酸鈉效果稍強(qiáng)一些。酚類物質(zhì)具有抑菌性機(jī)理可能是[14]：菌體蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)通過氫鍵或疏水作用相結(jié)合從而喪失了活性；抑制了微生物細(xì)胞中的特定酶，使代謝過程發(fā)生異常；可能與微生物細(xì)胞生長所必需物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致微生物死亡等。

表3 擴(kuò)散法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌效果Table3 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by diffusion test

圖3 擴(kuò)散法測定不同質(zhì)量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig3 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by diffusion test

表4 麝香草酚、苯甲酸鈉對細(xì)菌的抑菌效果Table4 Antimicrobial effects of thymol and sodium benzoate

2.4 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定結(jié)果

由表5可知，MIC測定結(jié)果得到了10種菌的最低抑菌質(zhì)量濃度，對細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為10、20、20μg/mL。麝香草酚對食品污染菌的抑菌作用大小比較：對細(xì)菌抑制作用＞對酵母抑制作用＞對霉菌抑制作用。對霉菌抑菌效果差可能是由于霉菌大多是通過孢子繁殖，麝香草酚則是通過瓊脂培養(yǎng)基慢慢擴(kuò)散與細(xì)胞接觸，因而對孢子抑制作用稍差而致[15]。麝香草酚是從可食用植物中提取出來的，安全性高，可考慮作為一種良好的天然食品防腐劑開發(fā)使用。

表5 麝香草酚對供試菌的最低抑菌質(zhì)量濃度Table5 MIC of thymol against different bacteria

3 結(jié) 論

具有抗菌作用的植物的使用要遠(yuǎn)比抗生素的歷史久遠(yuǎn)的多，從植物中尋找毒副作用小、安全性高的天然植物防腐劑，一直是研究的熱點(diǎn)[16-20]。麝香草酚的資源豐富，成本低，對細(xì)菌、霉菌、酵母都有較強(qiáng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，麝香草酚對食品中常見的10種污染菌均有一定抑菌效果，其中，對細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為10、20、20μg/mL?？傮w來看，麝香草酚對食品污染菌的最低抑菌質(zhì)量濃度都很小，在10～160μg/mL之間，而作為食品添加劑的用量一般在10g/L以下，麝香草酚抑菌劑量遠(yuǎn)低于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。因此是一種潛在的、很有前途的食品防腐劑。盡管麝香草酚的抑菌作用很好，但是其帶有一種強(qiáng)烈的芳香味可能對食品的風(fēng)味會(huì)產(chǎn)生一些不好的影響，因此限制了其使用的范圍，如何在保持其最大抑菌活性的基礎(chǔ)上，降低或消弱其強(qiáng)烈的芳香味，還有待進(jìn)一步研究。

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Antimicrobial Activity of Thymol against Foodborne Pathogenic Bacteria

WANG Di，XU Hui，QIAN Shi-quan，CAO Ke-ke，REN Mao-sheng，TIAN Chang-cheng
(Department of Biology and Food-Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The antimicrobial activity of thymol against foodborne pathogenic bacteria was studied by filter paper disks, Oxferd-cup test and diffusion test. The minimum inhibitory concentrations of thymol against10 kinds of foodborne pathogenic bacteria such as Proteus vulgaris, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus thermophilus, Hansenula Anomala, Saccharmuces cerevisiae, Aspergillus niger and Aspergillus flavus were determined. The results showed that thymol had obvious antimicrobial activity against these foodborne pathogenic bacteria in wide-spectrum manner. The minimum inhibitory concentrations of thymol against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Escherichia coli were 10, 20 μg/mL and 20 μg/mL, respectively.

thymol；antimicrobial activity；filter paper disk；Oxferd-cup test；diffusion test

TS202.3

A

1002-6630(2013)03-0119-04

2011-12-04

安徽省高校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目(2010SQRL116)

王娣(1976—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：Wangdibbxy@yahoo.cn