王鎮(zhèn)發(fā)，陳培欽，鄧秩韜，謝晨，李夏蘭

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門361021）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類，屬胞外酶，其主要生物功能是水解多糖與阿魏酸連結(jié)的酯鍵［1］.1987年，Mackenzie等［2］首次在橄欖色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了阿魏酸酯酶；1991年，F(xiàn)aulds等［3］成功分離純化了阿魏酸酯酶.到目前，已從真菌和細(xì)菌中得到超過40種阿魏酸酯酶［4-6］，各種微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽鏈的結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)和催化特性上有所不同［4-7］.阿魏酸酯酶的分離純化是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，所以阿魏酸酯酶的分離純化一直都是研究的一個(gè)重點(diǎn).相比于層析法，反膠束萃取蛋白質(zhì)具有成本低、回收率高、操作時(shí)間短和處理量大等優(yōu)點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)室已從腐爛的木質(zhì)纖維中篩選到1株產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定［8］.本文研究反膠束萃取法分離純化該菌種發(fā)酵所產(chǎn)的阿魏酸酯酶，為阿魏酸酯酶的應(yīng)用提供前期的基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；阿魏酸甲酯，華僑大學(xué)化工學(xué)院曾慶友老師合成；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），分析純，北京佰利申科貿(mào)有限公司；異辛烷，正己醇，甲醇，氯化鉀等均為市售，分析純.

DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Thermo EC120小型垂直電泳系統(tǒng)，美國Thermo公司；ODS-C18型色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm），美國Thermo公司；MW3500型透析袋，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司；XW-80A型漩渦混合儀，上海精科實(shí)業(yè)有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 菌種及發(fā)酵液的制備，參見文獻(xiàn)［9］.

1.2.2 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活的測(cè)定 阿魏酸的測(cè)定采用HPLC法［8］.阿魏酸酯酶活測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［9］.

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［10］.

1.2.4 反膠束萃取阿魏酸酯酶 1）萃取.用1 mol·L-1HCl溶液、1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)酶液p H值，用KCl調(diào)節(jié)酶液的離子強(qiáng)度.稱取一定質(zhì)量的CTAB加入小試管中，再加入2 m L體積比為1：5的正己醇／異辛烷溶液，振蕩片刻，加入等體積的酶液，漩渦振蕩2 min，室溫靜置；待分層后測(cè)定下層水相的酶活力和蛋白濃度，計(jì)算萃取率（E）和純化倍數(shù)（D）.2）反萃取.在另一只小試管中加入1.5 m L萃取相，再加入等體積一定p H值和濃度的KCl溶液，漩渦振蕩2 min，室溫靜置；待油水分層后測(cè)定下層水相中的酶活力和蛋白濃度，計(jì)算總萃取率（Et）和純化倍數(shù).

1.2.5 電泳 將經(jīng)反膠束萃取和反萃取的的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

2 結(jié)果與討論

2.1 p H值對(duì)萃取率的影響

在KCl濃度為0.01 mol·L-1時(shí)萃取阿魏酸酯酶，結(jié)果如圖1所示.從圖1可知：萃取液p H值為12時(shí)，萃取率最高，達(dá)到94.5%.p H值主要決定蛋白質(zhì)所帶的靜電荷，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)表面電荷和反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用［11］.CTAB是陽離子表面活性劑，極性頭帶正電.因此，只有在水相p H值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，才能被包裹進(jìn)反膠束中.該菌分泌的阿魏酸酯酶的pI值還未測(cè)定，但據(jù)報(bào)道，不同菌株來源的阿魏酸酯酶的pI值在3～10之間［12］.所以p H值越大，水相p H值和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差值越大，靜電作用就越強(qiáng)，萃取率就越高.

2.2 KCl濃度對(duì)萃取率的影響

在p H值為12時(shí)萃取阿魏酸酯酶，結(jié)果如圖2所示.從圖2可知：隨著離子濃度的增高，萃取率迅速降低，KCl濃度為0.5 mol·L-1時(shí)，萃取率只有15%.這可用雙電子層理論［11］解釋，即離子強(qiáng)度的增加減弱了表面活性劑極性頭之間的斥力，反膠束體積變小，蛋白質(zhì)甚至無法進(jìn)入反膠束.

圖1 p H值對(duì)萃取率的影響Fig.1 Effect of p H value on extraction efficiency

圖2 KCl濃度對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of concentration of KCl on extraction efficiency

2.3 CTAB濃度對(duì)萃取率的影響

在p H值為12，KCl濃度為0時(shí)萃取阿魏酸酯酶，結(jié)果如圖3所示.從圖3可知：當(dāng)CTAB濃度小于25 mmol·L-1時(shí)，萃取率隨著CTAB濃度的增加而提高.這是因?yàn)楸砻婊钚詣舛鹊脑黾邮狗茨z束的數(shù)量增加，萃取率提高.當(dāng)CTAB濃度達(dá)到25 mmol·L-1時(shí)，水相中的阿魏酸酯酶全部進(jìn)入反膠束中，萃取率接近100%.

2.4 反萃取時(shí)水相p H值對(duì)反萃取的影響

圖3 CTAB濃度對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of concentration of CTAB on extraction efficiency

優(yōu)化條件下（p H值為12，CTAB濃度為25 mmol·L-1，KCl濃度為0）對(duì)阿魏酸酯酶進(jìn)行萃取后，在0和0.15 mol·L-1的KCl溶液中進(jìn)行反萃取阿魏酸酯酶，結(jié)果如圖4所示.從圖4可知：當(dāng)KCl濃度為0.15 mol·L-1，p H值為5～10時(shí)，其反萃取率為70%左右；而當(dāng)p H＞8時(shí)，反萃取率下降.若KCl濃度為0時(shí)，改變水相的p H值，即使當(dāng)水相p H值低于阿魏酸酯酶的pI值時(shí)，阿魏酸酯酶帶正電荷與CTAB的極性頭所帶的正電荷排斥，也無法實(shí)現(xiàn)阿魏酸酯酶從反膠束中的反萃取.這說明在萃取中起作用的不只是靜電作用，還有其他的因素，如疏水相互作用［11］、立體相互作用和特異性相互作用［12］.

2.5 反萃取時(shí)水相的KCl濃度對(duì)反萃取的影響

用p H值為7的不同濃度KCl溶液進(jìn)行反萃取阿魏酸酯酶，結(jié)果如圖5所示.從圖5可知：隨著KCl濃度的升高，反萃取率逐漸增大，當(dāng)KCl濃度為0.20 mol·L-1時(shí)，反萃取率最高為79%.當(dāng)離子強(qiáng)度增大時(shí)，反膠束表面雙電層變?。?3］，阿魏酸酯酶與反膠束表面之間的靜電吸引減弱，酶在反膠束中的溶解度降低，從而使反萃取率提高.但進(jìn)一步提高KCl濃度，反萃取率開始下降，當(dāng)KCl濃度為0.25 mol·L-1時(shí)，萃取率僅為56%.這可能是較高的KCl濃度會(huì)導(dǎo)致酶的鹽析，從而使反萃取率降低.

圖4 反萃取水相的p H值對(duì)總萃取率的影響Fig.4 Effect of p H in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

圖5 反萃取水相KCl濃度對(duì)總萃取率的影響Fig.5 Effect of concentration of KCl in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

透析后粗酶液在p H值為12，CTAB濃度為25 mmol·m L-1，KCl濃度為0下萃取，在0.2 mol·L-1KCl下反萃取，酶活力（z）和蛋白濃度（c（蛋白質(zhì)））的變化如表1所示.通過萃取和反萃取，阿魏酸酯酶回收率（Et）為79.0%，比活（Δz）從51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，純化倍數(shù)（D）為6.9.

表1 阿魏酸酯酶純化的各參數(shù)Tab.1 Summary of the purification of feruloyl esterases

2.6 反膠束純化結(jié)果電泳

圖6為不同透析時(shí)間的阿魏酸酯酶液反膠束萃取純化后的SDS-PAGE電泳圖.其中：1為Marker；2為發(fā)酵液；3為經(jīng)反膠束萃取及反萃取的純化結(jié)果.從圖6中可知：在條帶35 ku左右有一條帶，與本實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)的相近［9］，為阿魏酸酯酶的條帶.同時(shí)還可以看出：CTAB反膠束純化阿魏酸酯酶有較好的效果，尤其是對(duì)除去分子量大于阿魏酸酯酶的蛋白質(zhì).

3 結(jié)論

圖6 阿魏酸酯酶液反膠束萃取后的電泳圖Fig.6 Electrophoresis of feruloyl esterase after reverse micelles extraction

研究結(jié)果表明：萃取時(shí)，透析后的粗酶液的p H值為12時(shí)，與等體積的25 mmol·L-1CTAB反膠束溶液混合，阿魏酸酯酶萃取率最高，接近100%；反萃取時(shí)，將反膠束與等體積p H值為7的0.20 mol·L-1KCl溶液混合，漩渦振蕩3 min，阿魏酸酯酶總得率最高為79%，比活從粗酶液的51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，純化倍數(shù)為6.9.阿魏酸酯酶酶液經(jīng)反膠束萃取后，SDS-PAGE電泳只顯示兩條帶，說明CTAB／正己醇／異辛烷反膠束體系能有效地分離純化阿魏酸酯酶.此方法與層析法相比，具有提取時(shí)間短、成本低、易于放大等優(yōu)點(diǎn).

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