周小林，王 成，申明強(qiáng)，陳 默，賀賜安，王軍平 (第三軍醫(yī)大學(xué):.軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院防原醫(yī)學(xué)教研室，全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.基礎(chǔ)部外科應(yīng)用解剖與手術(shù)學(xué)教研室，重慶400038)

半個(gè)多世紀(jì)以來抗生素的廣泛使用給臨床感染性 疾病的治療產(chǎn)生了革命性的深遠(yuǎn)影響。然而細(xì)菌多藥耐藥性的產(chǎn)生，給疾病的治療帶來了極大的困難，逐漸成為了世界性普遍關(guān)注和難以解決的問題，新型抗菌藥物的研制迫在眉睫。近年來發(fā)現(xiàn)的防御素，作為機(jī)體天然防御系統(tǒng)重要組成部分，廣泛分布于生物體內(nèi)，以其廣譜抗微生物活性和在有效劑量內(nèi)不產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)備受關(guān)注。人α防御素5(human α-defensin 5，HD5)是由35～55個(gè)氨基酸組成，分子量只有3～5 kD的富含半胱氨酸殘基的陽離子短肽，主要在人小腸潘氏細(xì)胞、生殖道上皮細(xì)胞及鼻黏膜細(xì)胞分泌表達(dá)，對革蘭氏陰性菌、陽性菌、病毒均有較強(qiáng)的殺滅作用［1］。HD5具有特定的空間結(jié)構(gòu)，廣泛的抗菌活性、細(xì)胞毒性和免疫趨化作用［2］。為了進(jìn)一步的新藥應(yīng)用的研究，我們選擇了不同藥用輔料進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，為下一步制劑配方的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

配制LB培養(yǎng)基所需的胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購自英國Oxoid公司，配制緩沖液所使用的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，輔料甘油、蔗糖、NaCL等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。藥用輔料羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、吐溫80、尼泊金甲酯鈉購自生工生物工程(上海)股份有限公司。原始大腸埃希菌(ATCC25922)菌株為本室凍存。多肽由杭州中肽生化有限公司合成(干粉狀)，用滅菌超純水配制，-70℃保存，取用時(shí)臨時(shí)用超純水配制成需要的濃度。其他設(shè)備如超凈臺、-70℃及4℃冰箱、pH計(jì)、培養(yǎng)箱、搖床、烘干機(jī)等設(shè)備均為本室所有。

1.2 方法

1.2.1 HD5抗菌活性檢測 原始大腸埃希菌E.coli菌株活化后，挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜約12 h形成種子液。將種子液1∶1 000接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min擴(kuò)增3 h至菌液OD(600)值為0.5 ～0.6 時(shí)取出，低溫(4℃)10 000 r/min 離心5 min。將菌體用緩沖液洗滌2次，再次測定菌液 OD(600)值，并將 OD(600)值調(diào)定為0.5，稀釋100 倍，制成2.5 ×106/mL 的懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔20 μl(總體積50 μl)，加入反應(yīng)終濃度分別為 25.00、12.50、6.25、3.12 μg/mL 的 HD5 多肽，每個(gè)終濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置各濃度輔料未加入HD5作為對照組。37℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)2 h后取出20 μl加入含1%LB液體的緩沖液中稀釋1 000倍，取出100 μl制作LB平板。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)超過12 h，計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)，分別計(jì)算細(xì)菌抑菌率［抑菌率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%］。根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)為后續(xù)加入藥用輔料的實(shí)驗(yàn)選擇合適的HD5濃度。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)選擇輔料種類及其濃度 根據(jù)輔料對HD5的保護(hù)機(jī)理以及輔料篩選的一般原則，結(jié)合有關(guān)該方面文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室對藥用輔料的前期研究，分別選取蔗糖、甘油、NaCl、吐溫80、HP-β-CD、尼泊金甲酯鈉作為單因素考察對象，并以抑菌率為響應(yīng)值，篩選出HD5的適宜的輔料及其濃度范圍。實(shí)驗(yàn)以各濃度輔料未加HD5為對照組，其中將未添加HD5和輔料的對照組稱為空白對照組，而各濃度輔料加入HD5為實(shí)驗(yàn)組。具體做法是:將菌液稀釋至2.5×106/mL后加入96孔板與12.5 μg/mL HD5和不同濃度的輔料反應(yīng)后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，從而計(jì)算出抑菌率，方法同前，統(tǒng)計(jì)并比較抑菌率。

1.2.3 抑菌率計(jì)算公式 實(shí)驗(yàn)組抑菌率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%;對照組抑菌率=(1-對照組平均菌落數(shù)/空白對照組平均菌落數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HD5抗菌活性檢測

不同終濃度HD5的抑菌率見圖1，隨著HD5質(zhì)量濃度的增加，抑菌率明顯升高。數(shù)據(jù)提示HD5終濃度為12.50 μg/mL時(shí)，其抑菌率在90% ～100%之間，既能達(dá)到較好的抑菌效果，又小于最低殺菌濃度，可以很好地反映HD5抗菌活性的量效關(guān)系，可將此濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的HD5終濃度。

圖1 不同濃度的HD5的抑菌率

2.2 保濕劑甘油對HD5抗菌活性的影響

本組數(shù)據(jù)顯示，與甘油濃度0組比較，實(shí)驗(yàn)組各濃度輔料的抑菌率均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是對照組抑菌率隨甘油體積濃度變化比較大(圖2)。10%甘油的抑菌率顯著低于其他組，且與甘油濃度0組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而加入20%甘油處理時(shí)，對照組抑菌率略有下降，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而40% ～50%甘油處理對照組抑菌率接近于實(shí)驗(yàn)組抑菌率，但由于40%～50%的甘油本身具有顯著的抑菌活性，無法判斷此濃度甘油是否會影響甘油的抑菌活性。因此，可選擇低于10%體積濃度的甘油作為HD5的保濕劑和潤滑劑，這個(gè)劑量不會影響到HD5的抗菌效果，又可以避免甘油表現(xiàn)出抑菌活性干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，40%以上甘油可作為防腐劑使用。

圖2 不同濃度甘油對HD5抑菌率的影響

2.3 穩(wěn)定劑NaCl和蔗糖對HD5抗菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示(圖3)，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組和對照組抑菌率均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，說明NaCl可明顯抑制HD5的抗菌活性。與只加HD5組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，因此NaCl不適合作為HD5的穩(wěn)定劑。而終濃度為3%～12%蔗糖的實(shí)驗(yàn)組和對照組比較抑菌率均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P ＞0.05。

圖3 加入不同濃度NaCl對HD5抑菌率的影響

2.4 防腐劑尼泊金甲酯鈉對HD5抗菌活性的影響

各濃度尼泊金甲酯鈉加入后，HD5抗菌活性檢測數(shù)據(jù)結(jié)果提示:與只加HD5組比較，質(zhì)量濃度0～1%的尼泊金甲酯鈉的抑菌率無明顯變化，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。隨著尼泊金甲酯鈉質(zhì)量濃度的增加，單獨(dú)加入尼泊金甲酯鈉的抑菌率呈現(xiàn)上升的趨勢，到1%時(shí)抑菌率與單獨(dú)加入HD5組抑菌率相同，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)提示加入1%尼泊金甲酯鈉的抑菌活性在加和不加HD5是相同的，很難判斷這個(gè)濃度的尼泊金甲酯鈉是否影響HD5的抗菌活性，因此此濃度不作備選。根據(jù)防腐劑的使用規(guī)則，盡量選取小劑量的防腐劑，即0.05%尼泊金甲酯鈉可作為HD5防腐劑濃度備選。

圖4 加入不同濃度尼泊金甲酯鈉對HD5抑菌率的影響

2.5 HP-β-CD和吐溫80對HD5抗菌活性的影響

從表面活性劑HP-β-CD的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出:與HP-β-CD濃度0組比較，實(shí)驗(yàn)組10% ～20%HP-β-CD的抑菌率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(圖5)。而單純加入各濃度HP-β-CD的對照組抑菌率均非常低，但呈現(xiàn)一定的上升趨勢，抑菌率均低于相應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)組。因此在選取HP-β-CD作為抗氧化劑時(shí)質(zhì)量濃度應(yīng)控制在5%及以下，以不影響HD5抗菌活性和發(fā)揮HP-β-CD對HD5的抗氧化作用及表面活性劑作用最佳狀態(tài)的基礎(chǔ)上選擇較低濃度。各質(zhì)量濃度吐溫80的實(shí)驗(yàn)組HD5抗菌活性檢測數(shù)據(jù)結(jié)果提示:與吐溫80濃度0組比較，實(shí)驗(yàn)組的抑菌率沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對照組中0.5%吐溫80的抑菌率明顯低于其他各組，2.5%～10%吐溫80的抑菌率與實(shí)驗(yàn)組比較無顯著差異，無法判斷是否影響了HD5的抗菌活性，因此可將0.5%吐溫80作為HD5的備選輔料濃度，見圖6。

圖5 加入不同濃度HP-β-CD對HD5抑菌率的影響

圖6 加入不同濃度吐溫80對HD5抑菌率的影響

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因重組技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)與多肽類藥物憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢已逐漸成為一種重要的臨床藥物類型。目前已經(jīng)批準(zhǔn)上市的抗菌肽藥物并不多，如多黏菌素和短桿肽菌是最早應(yīng)用于臨床的抗菌肽制劑，而2003年9月上市，用于治療由金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、鏈球菌以及腸球菌引起的皮膚感染的達(dá)托霉素則是一種Ca2+依賴的陰離子多肽藥物［3-4］。HD5作為一種陽離子小分子肽，抗致病微生物種類廣泛、抗菌活性高，但其抗菌機(jī)制目前仍然不是很明確，根據(jù)同源抗菌肽推測其機(jī)制可能為:HD5吸附到細(xì)胞膜上致使膜結(jié)構(gòu)通透性破壞，胞內(nèi)重要礦物質(zhì)、代謝物及小分子泄漏，致細(xì)菌死亡［5］。因此HD5可避免微生物產(chǎn)生耐藥，有望開發(fā)成為新型的抗菌藥物。但由于這類藥物穩(wěn)定性差，半衰期短，人體內(nèi)廣泛存在的各種酶類可以很快使其降解，失去活性［6］。因此HD5在生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸和給藥過程中都容易喪失活性，極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。藥用輔料是指在制劑處方設(shè)計(jì)過程中，為了解決制劑的有效性、穩(wěn)定性、安全性和成型性，加入到主藥中的一切藥物用料的統(tǒng)稱，是藥物制劑生產(chǎn)和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，在制劑和藥物生產(chǎn)中起著非常關(guān)鍵的作用。因此，在HD5制劑中添加各種輔料可起到穩(wěn)定藥物及延長使用期限等作用，這些輔料在有效濃度范圍內(nèi)不影響HD5抗菌活性，使藥物抗菌效果穩(wěn)定，在使用期間內(nèi)避免失活，最好還能與HD5起到協(xié)同抗菌作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及對于HD5的前期研究選取了甘油、NaCl、吐溫80、HP-β-CD 等輔料進(jìn)行了 HD5抗菌活性檢測的單因素實(shí)驗(yàn)，為后期制劑配方的選取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道HD5的體外抗菌濃度在10～100 μg/mL［7］，這個(gè)濃度范圍對正常功能的細(xì)胞無毒害作用［8-9］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著HD5濃度的降低，HD5的抗菌活性逐漸降低，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，選擇12.5 μg/mL作為后期輔料篩選的HD5的終濃度。根據(jù)HD5的生物特性，選擇HP-β-CD和吐溫80作為助溶劑和抗氧劑及表面活性劑。由于在制備液體藥劑過程中，防腐措施并不能完全保證無細(xì)菌污染，必要時(shí)應(yīng)添加適當(dāng)?shù)姆栏瘎┮种莆⑸锏纳L繁殖，甚至殺滅微生物，但原則上應(yīng)不用或少用防腐劑。因此本組選用尼泊金甲酯鈉作為防腐劑被納入實(shí)驗(yàn)。HP-β-CD易溶于水，對許多化合物具有優(yōu)良的包絡(luò)作用，可提高包絡(luò)物質(zhì)的穩(wěn)定性，在生物體內(nèi)可提高被包絡(luò)藥物的釋放速度和生物利用度，對人體無毒，是一種很好的藥物載體［10-11］。根據(jù)中國藥典記述的吐溫80不能與含酚羥基的消毒防腐劑配伍，如吐溫80與尼泊金類、三氯叔丁醇、苯甲醇等聯(lián)用時(shí)會導(dǎo)致其抑菌力減低。因此選用尼泊金甲酯鈉作為防腐劑時(shí)不宜選用吐溫80作為表面活性劑。甘油是較好的溶劑、保濕劑和潤滑劑，而NaCl和蔗糖分別作為穩(wěn)定劑納入實(shí)驗(yàn)［12］。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.29%NaCl和10%以上的HP-β-CD可使HD5的抑菌率明顯下降(P＜0.05)，說明這些輔料對HD5的抗菌活性有影響。且隨著NaCl濃度的增高，HD5的抑菌率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［13］。尼泊金甲酯鈉、甘油、吐溫80在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)組抑菌率無明顯變化，但1%尼泊金甲酯鈉的對照組抑菌率和實(shí)驗(yàn)組相同，此濃度下無法判斷是否影響了HD5的抗菌活性，故此濃度的尼泊金甲酯鈉不適合作為HD5的輔料。另外2.5%及以上的吐溫80、40%及以上的甘油的對照組抑菌率也和實(shí)驗(yàn)組相同，因此這些濃度最好不作為備選輔料。由于較高濃度的吐溫80、甘油和尼泊金甲酯鈉本身具有顯著抑菌活性，因此在這些濃度范圍內(nèi)即使不加HD5，抑菌率也很高［14］，很難判斷這種情況下HD5的活性有沒有受到影響，因此后期在選取這些輔料濃度時(shí)要注意區(qū)分二者的抑菌作用的主次關(guān)系。另有文獻(xiàn)報(bào)道，NaCl在5%以下即可對大腸桿菌起到抑制作用，因此如果繼續(xù)加大NaCl用量也可能起到抑菌作用，但這個(gè)作用可能不是HD5所賦予的，要注意區(qū)分［15］。

由于HD5是小分子物質(zhì)，有不穩(wěn)定、易被酶類分解等特性，用藥方式還是以局部應(yīng)用為主，主要通過皮膚、黏膜等給藥，而系統(tǒng)用藥比較少見。因此劑型主要是以外用和局部系統(tǒng)給藥為主，如膏劑、噴霧劑、洗液等。在HD5中加入適當(dāng)?shù)乃幱幂o料是藥物制劑的必要步驟，也是藥物研究非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

［1］Hazrati E，Galen B，Lu W，et al.Human alpha-and beta-defensins block multiple steps in herpes simplex virus infection［J］.J Immunol，2006，177(12):8658-8666.

［2］楊 榮，嵇 武.防御素的生物學(xué)活性及與疾病的關(guān)系［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2011，18(3):185-188.

［3］Fuchs PC，Barry AL，Brown SD.Daptomycin susceptibility tests:interpretive criteria，quality control，and effect of calcium on in vitro tests［J］.Diagn microbiol Infect Dis，2000，38(1):51-58.

［4］方 超，張曉鞏，周 穎，等.抗菌肽開發(fā)與應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國抗生素雜志，2010，35(11):809-814.

［5］吳學(xué)敏，盧 穎，單 穎，等.人防御素5基因畢赤酵母重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37(13):2496-2497.

［6］Tanabe H，Ayabe T，Maemoto A，et al.Denatured human alpha-defensin attenuates the bactericidal activity and the stability against enzymatic digestion［J］.Biochem and Biophys Res Commun，2007，358(1):349-355

［7］Benson VL，Khachigian LM，Lowe HC.DNAzymes and cardiovascular disease［J］.Br J Pharmacol，2008，154(4):741-748.

［8］Dass CR，Choong PF，Khachigian LM.DNAzyme technology and cancer therapy:cleave and let die［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(2):243-251.

［9］Marquet R，Isel C，Ehresmann C，et al.tRNAs as primer of reverse transcriptases［J］.Biochimie，1995，77(1-2):113-124

［10］陳星宇，辛劍宇，李建樹.環(huán)糊精及其衍生物在多肽蛋白質(zhì)藥物非注射給藥體系中的應(yīng)用［J］.中國生物工程雜志，2010，30(12):111-115.

［11］王亞南，王洪權(quán)，竇媛媛.羥丙基-β-環(huán)糊精在藥劑學(xué)中的應(yīng)用與研究［J］.食品與藥品，2007，7(4):47-50.

［12］秦華明，宗敏華，梁世中.糖在蛋白質(zhì)藥物冷凍干燥過程中保護(hù)作用的分子機(jī)制［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，17(4):305-307.

［13］吳瓊英，茅 妍.乳源抗菌肽的抑菌活性及其影響因素［J］.江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，24(2):184-187.

［14］王 健，侯百友，孫玉梅，等.吐溫-80、乙醚、NaCl對烴降解菌HB29產(chǎn)糖脂的影響［J］.中國釀造，2010，(5):113-115.

［15］孫之南，王 娟，魯梅芳，等.氯化鈉對幾種常見菌的抑制作用［J］.鹽業(yè)與化工，2007，36(1):12-15.