彭 燕程 也張斯文

1.長(zhǎng)春大學(xué)校醫(yī)院醫(yī)技科，吉林 長(zhǎng)春 130115；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

維生素C和維生素E聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

彭 燕1程 也2張斯文2

1.長(zhǎng)春大學(xué)校醫(yī)院醫(yī)技科，吉林 長(zhǎng)春 130115；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

目的：觀察維生素C（VitC）和維生素E（VitE）以及VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：采用夾閉腎蒂1h進(jìn)行并再通進(jìn)行缺血再灌注損傷的造模，再灌注前10min在不同分組的大鼠進(jìn)行舌下靜脈注入Vit（200mg/kg）；VitE乳劑（100mg/kg）以及Vit（200mg/kg）和VitC聯(lián)合使用。再灌注2h后測(cè)定腎組織勻漿MDA含量及SOD活性，血肌酐，尿素等指標(biāo)從而觀察缺血再關(guān)注損傷程度及藥物保護(hù)作用。結(jié)果：VitC給藥組、VitE給藥組以及VitC、E聯(lián)合給藥組的腎組織勻漿SOD活性明顯高于模型組，其中以VitC、E聯(lián)合給藥組最為顯著（p＜0.01）；MDA，血肌酐，血尿素值均低于模型組（p＜0.05），以VitC、E聯(lián)合給藥組改善最為顯著（p＜0.01）。VitC、E聯(lián)合給藥組與VitE給藥組和VitC給藥組相比也有顯著差異（p＜0.05）。結(jié)論：VitC和VitE對(duì)腎缺血再灌注損傷具有協(xié)同保護(hù)作用。

維生素C；維生素E；缺血再灌注損傷

腎缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，/RI）是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象，腎臟的移植是產(chǎn)生腎臟缺血再灌注損傷的主要情形。其中自由基損傷和脂質(zhì)過氧化是缺血再灌注損傷的主要機(jī)制［1］。對(duì)于腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)藥物近年來也在不斷的研究與開發(fā)之中，Nakagawa［2］和Cicalese［3］等證實(shí)了利用超氧化物歧化酶（SOD）和還原性谷胱甘肽的抗自由基及脂質(zhì)過氧化作用。但是由于SOD的來源受限以及價(jià)格比較昂貴，谷胱甘肽的作用發(fā)生需要阿爾法硫辛酸的存在下放能發(fā)揮作用。

因此我們可以考慮同樣具有抗氧化作用且方便而且價(jià)格便宜對(duì)人體副作用比較小的維生素C和維生素E作為缺血再灌注損傷的保護(hù)藥。

研究顯示，再灌注前經(jīng)脈注射VitC和（或）VitE乳劑可有效保護(hù)大鼠肺的缺血再灌注損傷，表現(xiàn)在組織損傷程度降低，肌酐尿素氮升高水平得到控制［3］。但是VitC和VitE對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)效果以及聯(lián)合運(yùn)用效果和與其它陽性藥物效果的比較目前缺少報(bào)道。因此我們用大鼠復(fù)制了腎缺血再灌注模型，進(jìn)行VitC和VitE乳劑以及聯(lián)合用藥對(duì)缺血再灌注保護(hù)作用的研究，通過檢測(cè)血肌酐、尿素氮、SOD和MDA等指標(biāo)對(duì)動(dòng)物缺血再灌注損傷程度進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠120只（健康狀況良好），體重232±10.8g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。平均分為6組，每組20只。1組為假手術(shù)組 （開腹不接扎腎蒂），給予生理鹽水注射0.5ml；2－6組進(jìn)行缺血再灌注造模處理（結(jié)扎腎動(dòng)脈60min）：其中2組每只給谷胱甘肽2mg/kg，加生理鹽水至0.5m l；3組每只給維生素C 200mg/kg，加生理鹽水至0.5m l；4組每只給維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5m l；5組為維生素C、E聯(lián)合給藥，每只給維生素C 200mg/kg、維生素E 100mg/kg，加生理鹽水至0.5m l；6組為模型組，給予生理鹽水每只0.5ml。

1.2 主要藥品與試劑 VitC；購自長(zhǎng)春亞泰藥業(yè)集團(tuán)（批號(hào)：20090803）；VitE；購自長(zhǎng)春亞泰藥業(yè)集團(tuán)（批號(hào)：20090815）；還原性谷胱甘肽：購自重慶藥友制藥有限責(zé)任公司（批號(hào)：20100321）；MDA試劑盒：購自長(zhǎng)春生物制

品所（批號(hào)：20090923）；尿素氮試劑盒：購自長(zhǎng)春生物制品所（批號(hào)：20090925）；肌酐（Cr）試劑盒：購自長(zhǎng)春生物制品所（批號(hào)：20090809）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：購自長(zhǎng)春生物制品所（批號(hào)：20090703）。

1.3 復(fù)制缺血再灌注損傷模型 3%的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。腹腔注射20%烏拉坦0.5ml/100g，麻醉徹底后，大鼠按仰臥位固定，經(jīng)腹腔入路。從大鼠腹側(cè)正中劍突下方向下開一約5cm的口，將腸管翻至體外，找到兩側(cè)腎臟后，用結(jié)扎線結(jié)扎腎蒂，結(jié)扎線系活結(jié)，結(jié)扎完畢后將腸管還納，用止血鉗將切口鉗住。皮下注射少量生理鹽水。結(jié)扎時(shí)間為60min，再灌注前10min進(jìn)行舌下靜脈給藥。手術(shù)結(jié)束后，切口周圍用青霉素消毒，之后進(jìn)行縫合。給藥2小時(shí)后，準(zhǔn)備進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。之后打開腹腔。分離暴露腹主動(dòng)脈，用注射器直接穿刺動(dòng)脈采血5ml用于血漿中MDA，肌酐（Cr）和尿素氮 （BUN）的檢測(cè)。之后繼續(xù)抽血，處死動(dòng)物。同時(shí)分離左腎，取腎上極組織0.5g，用4.5m l生理鹽水在4℃下用電動(dòng)勻漿機(jī)以12000r/min研磨制成10%腎組織勻漿。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測(cè)定腎組織MDA含量，SOD含量，血肌酐含量，學(xué)尿素氮含量，腎組織形態(tài)學(xué)觀察，取腎下極組織，置于4%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用 （±s）表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MDA的測(cè)量值 MDA吸光度的測(cè)量結(jié)果見表1，計(jì)算后的MDA值見表2。

經(jīng)計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P＜0.05；經(jīng)維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P＜0.05。

2.2 血肌酐的測(cè)量值 血肌酐測(cè)量值見表3，經(jīng)計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P＜0.05；經(jīng)維生素C和維生素E處理后MDA值低于維生素C組和維生素E組，P＜0.05。

2.3 血尿素的測(cè)量值 血尿素的測(cè)量值見表4：計(jì)算后的MDA值在假手術(shù)組最低，并且在模型組最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)T檢驗(yàn)表明：經(jīng)維生素C和維生素E處理后的動(dòng)物的MDA值低于模型組（六組）P＜0.05。

2.4 各組大鼠腎組織HE染色病理改變 光鏡下可見假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)未見明顯異常。模型組大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，部分腎小管管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)可見蛋白性液體、紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片，腎間質(zhì)高度充血、炎細(xì)胞浸潤明顯。

其余3個(gè)治療組腎組織病變與缺血再灌注組比較均有所減輕，僅見少部分腎小管管腔擴(kuò)張，偶見管型，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤不明顯。上述各組均未見腎小球明顯病理改變。

3 討論

由于缺血再灌注損傷主要機(jī)制為自由基損傷和脂質(zhì)過氧化等等。因此，缺血再灌注損傷的治療和實(shí)驗(yàn)研究方面多圍繞這兩個(gè)方面展開［4］。SOD活力的高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力，而MDA的量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。血肌酐和尿素氮是反應(yīng)腎損傷的敏感指標(biāo)，可間接反應(yīng)腎臟受缺血再灌注損傷的程度。

3.1 維生素C及維生素E對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在給予維生素C和維生素E的處理后，SOD，MDA，肌酐和血尿素的數(shù)值有了顯著的改善，表明它們具有顯著的抗氧化作用。結(jié)果與梁應(yīng)平［5］和蔡虹靜［6］等研究結(jié)果基本一致。

由于維生素C具有重要的抗氧化性，它還能防止脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)維生素E循環(huán)再生，清除體內(nèi)自由基和活性氧物質(zhì)，防止癌癥的發(fā)生和惡化。維生素C的多項(xiàng)生理功能都與其抗氧化性有關(guān)。作為一種天然的水溶性抗氧化劑，它能直接清除生理代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基，使機(jī)體免受損害［7］。維生素E是O－2的直接清除劑，與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物一起構(gòu)成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的核酸免受自由基的攻擊。報(bào)道［8］維生素E能保護(hù)LDL免遭氧化損傷，可有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca2＋攝入的作用，而LDL可能正是血管氧化損傷的主要成分。

3.2 維生素C與維生素E聯(lián)合應(yīng)用對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 通過MDA值的計(jì)算（表2），在VitCE聯(lián)合用藥處理組（5組）的MDA值顯著低于模型組（6組）；并且5組與3組和4組也有顯著的差異（P＜0.05），表明維生素CE聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用要明顯好于直接應(yīng)用維生素C或維生素E。

同時(shí)血尿素和血肌酐的測(cè)定結(jié)果表明 （表3，表4）：VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用后與維生素C或維生素E單獨(dú)使用相比具有更好的缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

其中VitE單獨(dú)使用對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用較低（SOD值較低，MDA，肌酐，尿素氮值較高），這可能與VitE－自由基還原成VitE，有助于/VitE的再生0，從而發(fā)揮協(xié)同抗氧化功能［9］。

而維生素CE聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同抗缺血再關(guān)注的機(jī)制尚不清晰?？赡芘c以下機(jī)制有關(guān)：

第一：維生素C和維生素E都是抗氧化劑，均具有抗自由基損傷和紙質(zhì)過氧化的功能，起協(xié)同作用。同時(shí)由于VitC為水溶性，VitE為脂溶性，他們的聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同效果［10］；第二：由于維生素E的存在也能防止維生素C的氧化，保證在體內(nèi)的生理功能，如維生素E能直接接受自由基的氧化，從而預(yù)防和消除Fe2＋和Cu2＋所引起的維生素C的不良反應(yīng)。同時(shí)，VC具有重要的抗氧化性，當(dāng)VitE（生育酚）與自由基起反應(yīng)后，即轉(zhuǎn)變?yōu)樯恿u基自由基，此化合物可被維生素C重新還原為生育酚，重新發(fā)揮其抗氧化作用［11］；第三：預(yù)先

給予VitC對(duì)組織中脂質(zhì)過氧化物（LPO）的生成有一定的抑制作用，且VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果更好［10］，同時(shí)也增加超氧化物歧化酶活性。

4 討論

目前關(guān)于缺血再灌注損傷的保護(hù)藥主要以超氧化物歧化酶 （SOD）、還原型谷胱甘肽、亞硝酸納等藥物為主。但是它們?cè)谑褂蒙隙加幸欢ǖ木窒扌?，SOD的價(jià)格以及還原型谷胱甘肽的易氧化性使得它們的臨床應(yīng)用還具有一定的弊端。亞硝酸鈉通過NO對(duì)缺血再灌注起到保護(hù)作用同樣面臨易被氧化，此外，亞硝酸鹽類物質(zhì)的毒性不可忽略。VitC和VitE的聯(lián)合使用使它們的治療效果大大提升，以至基本接近亞硝酸鈉的水平，并且它們的來源方便，對(duì)人體沒有危害較小，同時(shí)，VitC和VitE具有的美白和滋潤肌膚等功效也會(huì)使它們的功能復(fù)合化和多元化，因此會(huì)在臨床上預(yù)防和治療缺血再灌注損傷有著很好的應(yīng)用前景。但是，考慮到VitC和VitE的溶解性存在一定的差異，在復(fù)方制藥上會(huì)有一定的難度，同時(shí)，VitC和VitE的相互作用機(jī)制還需要深層次的探討以及聯(lián)合用藥缺少臨床的實(shí)際觀察，因此，VitC和VitE聯(lián)合應(yīng)用于缺血再灌注損傷還需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

表1 吸光度的測(cè)定值（×10－2）

表2 MDA計(jì)算值（nmol/ml）

表3 血尿素的測(cè)定（mmol/L）

表4 血肌酐測(cè)定（×10－1mg/dL）

表6 腎組織勻漿SOD值的測(cè)定（U/mgprot）

［1］石旦.腎缺血再灌注損傷及其保護(hù)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（18）：2802－2805.

［2］NakagawaK，KooDD，Davies D R，et al.Lecithinized superoxide dismutase reduces cold ischemia－induced chronic allograft dysfunction［J］.Kidney Int，2002，61（3）：1160－1169.

［3］Cicalese L，Yacoub W，Subbot in V，et al.Pyruvate inhibit sthechronic damage which ensues after ischemia/reperfusion injury of kidneys［J］.Transplant Proc，1999，31（1－2）：1033.

［4］于芹超，朱同玉，張永康.黃芪甲甙對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（3）：379－379.

［5］梁應(yīng)平胡衍輝周志東等.維生素C對(duì)糖尿病大鼠腎缺血－再灌注損傷的影響［J］.臨床麻醉學(xué)雜志，2011，27（5）：504－506.

［6］蔡虹靜蘇慶國徐芳等.黃芪注射液和維生素E聯(lián)合使用對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響.中醫(yī)雜志，2011，52（7）：1496－1499.

［7］許友卿，易波，丁兆坤.維生素E和維生素C的協(xié)同抗氧化作用及對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的影響［J］.飼料工業(yè)，2011，32（14）：59－62.

［8］葛穎華，鐘曉明.維生素C和維生素E抗氧化機(jī)制及其應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2007，5（1）：46－51.

［9］Das DK，Maulik N.Ant ioxidant effect iveness in ischemia－reperfusion tissue injury［J］.Methods Enzymol，1994，233（4）：601－610.

［10］臧亞茹.維生素C與維生素E聯(lián)合應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.河北醫(yī)藥，2009，31（5）：590－592.

［11］朱長(zhǎng)林，張文彬，孫鵬等.維生素C與維生素E的聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用［J］.中國臨床康復(fù)，10（36）：120－122.

Effect of vitamin C and vitamin E combination on the protection of renal ischemia reperfusion injury in rats

Yan Peng1，Ye Cheng2，Siwen Zhang2
1.Changchun University Hospital，Medical department；2.Norman Bethune Medical School of Jilin University.

Purpose：to observe the protective effect and mechanism of Vitamin C，Vitamin E and both Vitamin C and Vitamin E on renal ischemia reperfusion injury in rats.Method：We clamped the renal pedicle to make the model and injected vitamin C（200mg/kg），vitamin E emulsion（100mg/kg），and both vitamin C and vitamin E from the sublingual vein at the time of 10 minutes before reperfusion.2 hours after reperfusion the amount of MDA and the activity of SOD in the renal tissue homogenate and creatinine and urea in the blood were measured to observe the degree of the ischemia reperfusion injury.Results：the activity of SOD was enhanced in vitamin C group，vitamin E group and vitamin C combine E group compared to the model group（p＜0.05）especially in vitamin C combine E group（p＜0.01）.The amount of MDA，creatinine and urea was also decreased vitamin C group，vitamin E group and vitamin C combine E group especially in vitamin C combine E group（p＜0.01）.Besides，the activity of SOD was enhanced vitamin C combine E group compared to vitamin C group and vitamin E group（p＜0.05），the amount of MDA，creatinine and urea were decreased in vitamin C combine E group obviously compared to vitamin C group and vitamin E group.Conclusion：vitamin C and vitamin E have a have a protective effect of the ischemia reperfusion injury and combination of both is better in result.

vitamin C；vitamin E；ischemia reperfusion injury.

R151.2

A

1007－8517（2013）10－0023－03

2013.03.26）