沃燕波，鄒繼華，黃幸雷，張桂春，馬葵芬

(1、寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波315100；2、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310003)

不同廠家試劑檢測亮氨酸氨基肽酶的方法比對

沃燕波1，鄒繼華1，黃幸雷1，張桂春1，馬葵芬2

(1、寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波315100；2、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310003)

目的對不同廠家試劑檢測亮氨酸氨基肽酶(LAP)結(jié)果的可比性及偏倚進(jìn)行評估。方法依照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)EP9-A2文件規(guī)定，連續(xù)5 d收集不同濃度范圍分布的40個新鮮血清標(biāo)本，使用5個不同廠家LAP試劑，每個標(biāo)本均按正反順序重復(fù)兩次，記錄測定結(jié)果，檢查離群點、計算線性方程及相關(guān)系數(shù)，并對其進(jìn)行偏倚評估。結(jié)果各廠家試劑與Randox試劑方法間的相關(guān)性良好(r＞0.975)，但僅美康和利德曼試劑與Randox試劑檢測結(jié)果的預(yù)期偏倚小于允許誤差。結(jié)論各廠家的試劑與Randox試劑檢測結(jié)果相關(guān)性良好，但檢測結(jié)果并不完全一致。

亮氨酸氨基肽酶；方法比對；偏倚評估

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)是一種蛋白分解酶，能水解肽鏈N端以及由亮氨酸與其它氨基酸所形成的肽鍵，廣泛分布于肝、胰和腎等組織中，當(dāng)這些組織發(fā)生病變時其水平升高[1]。研究顯示，LAP對膽汁淤積性肝炎、膽道梗阻及胰腺癌的診斷有價值，其肝癌的檢出陽性率較腺苷脫氨酶高，診斷肝臟疾病比谷氨?；D(zhuǎn)移酶更靈敏，其也可早期反映腎損害的性質(zhì)和程度，為臨床鑒別腎小球、腎小管損傷提供幫助，其還可作為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥及孕婦和胎兒健康情況動態(tài)監(jiān)測的一項指標(biāo)[2-4]，因此必須重視其檢測結(jié)果的正確性。為此，我們按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南文件EP9-A2要求對5個不同廠家LAP試劑檢測結(jié)果進(jìn)行了比對和偏倚評估[5-7]，以了解不同廠家試劑在檢測LAP時是否存在差異以及測定結(jié)果的可比性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集參照文件[5]，收集日常進(jìn)行LAP檢測的新鮮、無溶血、無黃疸、無乳糜血清標(biāo)本40份，儲存于4℃冰箱。

1.1.2 LAP試劑購自Randox公司(批號：241695)、日本和光公司(批號：TR370)、北京利德曼公司(批號：204241A)、溫州伊利康公司(批號：111003)、寧波美康生物科技股份有限公司(批號：20120810)。

1.1.3 儀器日立7180全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本測定每天收集檢測范圍均勻分布的8份患者新鮮血清，連續(xù)5d，共40份樣本。每份樣本都用5種試劑各自進(jìn)行雙份測定，測定順序依1～8測定第1次，再按反序8～1測定第2次，以減少交叉污染及漂移對重復(fù)測定標(biāo)本平均值的影響，順序中的濃度應(yīng)盡可能隨機排列。同一標(biāo)本均在2 h內(nèi)完成兩法的測定。

1.2.2 離群值檢查根據(jù)文件[5]，對各系統(tǒng)內(nèi)和方法間進(jìn)行組內(nèi)與組間離群值檢查。

1.2.3 作圖及線性關(guān)系的目測檢查散點圖1：Y軸為實驗方法每樣本雙份測定的均值(Yi)；X軸為比較方法每樣本份測定的均值(Xi)。散點圖2：Y軸為實驗方法每樣本雙份測定值(Yij)；X軸為參比方法每樣雙份測定的均值(Xi)。偏倚圖1：Y軸為(Yi-Xi)；X軸為(Yi+Xi)/2，以直線X=0作水平中線作圖。偏倚圖2：Y軸為(Yij-Xi)；X軸為(Yi+Xi)/2，以直線X=0作為水平中線作圖。據(jù)圖目測評價圖的相對線性、足夠范圍和離散的均勻性。

1.2.4 X值合適范圍的檢驗根據(jù)文件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計算[5]，如果r≥0.975，則認(rèn)為X范圍適合，數(shù)據(jù)滿足要求。X的誤差可以由數(shù)據(jù)范圍給以適當(dāng)補償，并且簡單的線性回歸可以用來評價斜率和截距。

1.2.5 線性回歸分析根據(jù)文件[5]，計算兩個方法間的線性回歸方程：Y=a+bX。

1.2.6 預(yù)期偏倚及可信區(qū)間計算根據(jù)文件[5]，在醫(yī)學(xué)決定水平，利用回歸方程計算預(yù)期偏倚及95%可信區(qū)間，以預(yù)設(shè)的允許誤差10%為限，將預(yù)期偏差的可信區(qū)間與之進(jìn)行比較，當(dāng)預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限＜允許誤差＜預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限時，實驗方法與比對方法相當(dāng)；當(dāng)預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限＜允許誤差時，實驗方法與比對方法相當(dāng)，偏差可接受；預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限＞允許誤差時，實驗方法與比對方法不相當(dāng)，偏差不可接受。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理、作圖分析及偏差評估計算。

2 結(jié)果

2.1 散點圖、偏倚圖分析以國際著名診斷試劑廠家Randox試劑檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果為X，其余各廠家試劑的檢測結(jié)果為Y，經(jīng)組內(nèi)、組間離群值檢驗后，作散點圖和偏倚圖；從散點圖中可以較為直觀地看出各廠家的試劑與Randox試劑方法間的線性關(guān)系良好。如圖1、2為美康試劑與Randox試劑的散點圖，目測可見美康試劑LAP測定值與Randox試劑LAP測定值呈直線關(guān)系，說明兩方法相關(guān)性較好。偏倚圖1、2分別檢查的是兩種方法重復(fù)測定均值間的差異和兩種方法測定值間的差異，反映兩種方法間是否存在系統(tǒng)誤差，從作圖結(jié)果來看，美康、利德曼試劑分別與Randox試劑測定同一份血清時差值較小，分布較為合理，而和光試劑測定值普遍高于Randox試劑，伊利康試劑測定值普遍低于Randox試劑，說明兩方法間結(jié)果存在差異，并且待測標(biāo)本的濃度越高，這種差異越大。圖3、4示美康試劑與Randox試劑的偏倚圖。圖5、6示和光試劑與Randox試劑的偏倚圖。

2.2 X值合適范圍的檢驗及線性回歸分析結(jié)果如表1所示，各廠家的試劑與Randox試劑的r＞0.975，說明測定范圍足夠?qū)?，誤差的影響可以忽略不計，也說明回歸統(tǒng)計的斜率b和截距a可靠。

圖1 LAP重復(fù)測定均值的散點圖

圖2 LAP各次測定結(jié)果的散點圖

圖3 LAP重復(fù)測定均值偏差圖

圖4 LAP各次測定結(jié)果偏差圖

圖5 LAP重復(fù)測定均值偏差圖

圖6 LAP各次測定結(jié)果偏差圖

表1 相關(guān)系數(shù)及直線回歸方程

2.3 偏差估計計算預(yù)期偏差及其可信限范圍，根據(jù)EP9-A2文件提供的公式[5]，并選擇60 U/L作為LAP的醫(yī)學(xué)決定水平[8,9]，對預(yù)期偏倚及可信區(qū)間進(jìn)行計算，判斷兩種檢測方法是否相當(dāng)。我們以預(yù)設(shè)的允許誤差10%為限，按照“二分之一允許誤差”的標(biāo)準(zhǔn)[6]，計算得其允許偏倚為3 U/L，由回歸方程計算的預(yù)期偏差見表2，結(jié)果顯示，美康和利德曼試劑的預(yù)期偏差95%可信區(qū)間上限＜3 U/L，說明其與Randox試劑偏倚可接受，試劑間檢測結(jié)果具有良好的可比性，而和光和溫州伊利康試劑的預(yù)期偏差95%可信區(qū)間下限＞3 U/L，說明其測定結(jié)果與Randox試劑測定結(jié)果間的差異較為顯著，超出了預(yù)設(shè)的允許誤差范圍，方法間所得的檢測結(jié)果不一致。

表2 預(yù)期偏倚及可信區(qū)間的比較

3 討論

LAP位于細(xì)胞的微粒體內(nèi)，在肝臟主要定位于毛細(xì)膽管上皮細(xì)胞，不同肝病其活性增高程度不同，由高至低為依次肝癌、急性肝炎、肝硬化、慢性肝炎，其中肝癌陽性檢出率最高，因此，LAP作為肝癌鑒別診斷的一項初步指標(biāo)，值得推廣[1]。此外，由于LAP不像其他肝功能酶，只能檢測血液樣本，其還可以檢測尿液，在一些病例中可以不必采血而進(jìn)行檢驗，因此應(yīng)用起來十分方便[10]。本實驗根據(jù)CLSI EP9-A2文件的流程[5-7]，對市場上5個廠家試劑的測定結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，各廠家試劑的檢測結(jié)果的重復(fù)性均較好，沒有方法內(nèi)和方法間離群值，當(dāng)以國際著名診斷試劑廠家Randox試劑的檢測系統(tǒng)為比較方法時，其余各廠家試劑與其的線性關(guān)系良好，說明各廠家試劑與Randox試劑的相關(guān)性較好。進(jìn)一步我們通過偏差估計發(fā)現(xiàn)，美康和利德曼試劑與Randox試劑偏倚可接受，說明美康和利德曼試劑與Randox試劑的檢測結(jié)果具有良好的可比性，而和光和溫州伊利康試劑測定結(jié)果與Randox試劑測定結(jié)果間的差異較為顯著，由回歸方程計算的預(yù)期偏差超出了預(yù)設(shè)的允許誤差范圍，可見，和光和溫州伊利康試劑與Randox試劑所得的檢測結(jié)果不一致。由于目前還沒有LAP的參考物質(zhì)，且還未制定出參考測量程序，因而尚難對各廠家測定結(jié)果的正確性做出判斷，但根據(jù)本研究的圖形分析及相關(guān)回歸分析可知，各試劑在檢測范圍內(nèi)相關(guān)性良好，因此根據(jù)回歸方程對檢測結(jié)果進(jìn)行系數(shù)調(diào)整，可使方法間測定結(jié)果具有一致性與可比性。

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Method comparision of the kits from different manufactures in detecting of Leucine aminopeptidase

WO Yanbo,ZOU Ji- hua,HUANG Xinglei,et al.Ningbo Medicalsystem Biotechnology Co.,Ltd,Zhejiang Ningbo 315100，China

ObjectiveTo assess the comparability and bias of the LAP test results detected with leucine aminopeptidase(LAP) reagent from different manufacturers.Methods According to US National Clinical Laboratory Standards Committee(CLSI)EP9-A2, forty fresh serum samples covering different concentrations were continuously collected for 5 days.The collected samples were detected using LAP reagents made by 5 different manufacturers.Each sample was measured twice with the positive and negative order.The results were recorded to check the outliers and to calculate the linear equations and correlation coefficients,and to estimate the bias.Results The correlation between the tested reagents made by different manufacturers and Randox reagent was good (r＞0.975).Compared with Randox reagent,the expected bias of the results detected with the reagents manufactured by Meikang and Lideman was less than the allowable error region.Conclusion Though the correlation of the tested reagents is good,the detection results are not consistent.

Leucine aminopeptidase;Method comparison;Bias estimation

R446.11+2

A

1674-1129(2013)01-0010-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.004

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金(No 2011ZA053)

沃燕波，女，1980年生，畢業(yè)于浙江大學(xué)，醫(yī)學(xué)博士，中級工程師，從事體外診斷試劑開發(fā)研究。