張貴生，吳紅松，朱道玉，周長路，張紅梅

（菏澤學院 生命科學系，山東 菏澤 274015）

酞酸酯（PAEs）被廣泛應用于醫(yī)療產(chǎn)品、建筑材料、雨衣、油漆、顏料等，其中90%用作增塑劑，由于酞酸酯與聚氯乙烯塑料的結合是以氫鍵和范德華力結合，容易從塑料中滲漏出來，進入到大氣、水體和土壤中，因此酞酸酯已成為全球性無處不在的環(huán)境污染物［1］.有研究表明，酞酸酯類化合物具有生殖毒性［2］，遺傳毒性［3］，能影響動物酸性和堿性磷酸酶活性［4］及抗氧化性能［5］等.魚類屬于較低等的脊椎動物，以血清免疫球蛋白為中心的特異性免疫還比較原始［6］，非特異性細胞免疫在魚類的免疫防御中發(fā)揮著重要作用［7］.魚類黏液細胞是普遍存在于魚類上皮中的一種腺體細胞，主要分布于魚的皮膚、鰓和消化道上皮，能分泌大量黏液，黏液中富含糖蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶等多種活性物質，在魚類非特異性免疫中起重要作用.目前，關于PAEs對水生生物的毒性報道較少，對魚類黏液細胞的影響國內外鮮見報道.鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）是PAEs類化合物中應用較廣泛的增塑劑，已被美國國家環(huán)保局及中國列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物之一［8］.本課題組以DEP為研究對象，以中國第一大養(yǎng)殖魚種鯉魚（CyprinuscarpioLinnaeus）為受試動物，研究了DEP對鯉魚鰓及消化道黏液細胞密度的影響，期望能為PAEs的科學應用，探討PAEs對魚類的免疫毒性作用機制提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

鯉魚，由菏澤市牡丹區(qū)魚苗養(yǎng)殖場提供，體重為（65±4.2）g.染毒前在室溫條件下馴養(yǎng)7d.每日上午飼喂餌料1次，2天換水1次，每次換去1／3水量，24h充氧機充氧.

1.1.2 試劑

DEP（Eastman chemical company生產(chǎn)）；吐溫80、體積分數(shù)為95%的酒精、無水酒精、二甲苯、石蠟、鹽酸、阿利新藍等均為國產(chǎn)分析純；希夫試劑（南京建成生物工程研究所提供）.

1.1.3 儀器

自動組織染色機、冷凍臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、輪轉組織切片機、自制玻璃缸（120cm×80cm×60cm）等.

1.2 方法

1.2.1 動物的處理

將馴養(yǎng)好的鯉魚，挑選身體健康、無損傷、大小基本一致的鯉魚，平均分為6組，空白對照組（不添加吐溫80及 DEP），吐溫80組，0.125，0.5，2，8mg／L DEP組（各DEP處理組吐溫80質量分數(shù)均小于0.01%），每組10條，并設2個重復.染毒在同一規(guī)格的玻璃缸內進行，每天早晨8：00飼喂1次，充氧機24h不間斷充氧，每個實驗組2天換1次水，每次換1／3水量，并清除多余的殘餌，染毒20d.

1.2.2 切片的制作

染毒20d，從每組隨機取鯉魚6尾解剖，取鰓、口腔上皮、前腸、中腸、后腸，用質量分數(shù)為0.65%的生理鹽水沖洗，Bouins液固定24h，常規(guī)石蠟連續(xù)切片，AB－PAS（阿利新藍和過碘酸雪夫氏）染色方法染色［9］.

1.2.3 黏液細胞的分類、計數(shù)及統(tǒng)計分析

在Motic Digital microscop系統(tǒng)下采像，為了減少誤差，同一條魚同一部位至少觀察12張切片，每張切片隨機觀察10個視野，記錄觀察到的黏液細胞的類型、數(shù)量、面積.黏液細胞密度以平均值±標準偏差來表示，并用SPSS軟件對吐溫80組和各DEP染毒組進行單因素方差分析（ANOVA），與吐溫80組間的兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD），P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著.各黏液細胞類型的密度以平均值來表示.

2 結果與分析

2.1 DEP對鯉魚黏液細胞密度的影響

吐溫80組與對照組相比，鰓絲、口腔上皮、前腸、中腸、后腸處的黏液細胞密度變化并不明顯（表1），所以可以排除吐溫80對黏液細胞密度的影響.

表1 DEP對鯉魚黏液細胞密度的影響Tab.1 Effects of DEP on mucous cells density of Cyprinuscarpio Linnaeus

表1顯示，各DEP處理組與吐溫80組相比，鰓絲、口腔上皮處黏液細胞密度均隨DEP質量濃度的升高而減小，且0.125mg／L組黏液細胞密度與吐溫80組相比無顯著性差異，0.5，2，8mg／L組鰓絲處黏液細胞密度極顯著低于吐溫80組，0.5mg／L組口腔上皮處黏液細胞密度顯著低于吐溫80組，2，8mg／L組極顯著低于吐溫80組.表1還顯示，0.125，0.5mg／L組前腸、中腸、后腸處黏液細胞密度與吐溫80組相比無顯著性差異，但2，8mg／L組前腸、中腸、后腸處黏液細胞密度均極顯著低于吐溫80組，且DEP質量濃度越大，黏液細胞密度降幅越大，8mg／L組前、中、后腸黏液細胞密度比吐溫80組分別降低了14.3%，20.6%，26.7%.以上分析結果表明：較低質量濃度的DEP對鰓及消化道黏液細胞密度無明顯影響，但較高質量濃度的DEP則能顯著降低鰓及消化道黏液細胞的密度.

2.2 DEP對鯉魚各類型黏液細胞密度的影響

魚類黏液細胞類型參考尹苗［10］的分類方法，分為4種類型（圖1），Ⅰ型，呈紅色，含PAS陽性的中性黏多糖；Ⅱ型，呈藍色，含AB陽性的酸性黏多糖；Ⅲ型，呈紫紅色，主要含有PAS陽性的中性黏多糖，同時含有少量AB陽性的酸性黏多糖；Ⅳ型，呈藍紫色，主要含有AB陽性的酸性黏多糖，同時含有少量PAS陽性的中性黏多糖.

圖1 空白對照組中腸，示 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞Fig.1 Midgut with the blank control showing mucous cells of typeⅠ，Ⅱ，ⅢandⅣ

用不同質量濃度的DEP對鯉魚染毒20d后，其鰓及消化道不同部位4種類型黏液細胞密度的變化情況見表2.表2顯示，吐溫80組與對照組相比，鰓絲和消化道各類型黏液細胞的密度變化均不明顯，所以吐溫80對4種類型黏液細胞密度的影響可以不予考慮.

表2 DEP對鯉魚各類型黏液細胞密度的影響Tab.2 Effects of DEP on density of each types of mucous cells in Cyprinuscarpio Linnaeus

從表2中可看出，在DEP染毒20d后，與吐溫80組相比，鰓絲處Ⅰ，Ⅲ型黏液細胞密度，口腔上皮處Ⅰ型黏液細胞密度均隨DEP質量濃度的升高，表現(xiàn)為先升高后降低，口腔上皮處Ⅲ型黏液細胞密度表現(xiàn)為逐漸降低，但0.125，0.5，2mg／L組鰓絲處Ⅰ，Ⅲ型黏液細胞密度，口腔上皮處Ⅰ型黏液細胞密度及0.125，0.5mg／L組口腔上皮處Ⅲ型黏液細胞密度均高于吐溫80組，而8mg／L組鰓絲、口腔上皮處Ⅰ，Ⅲ型黏液細胞密度均低于吐溫80組.DEP各處理組鰓絲、口腔上皮處Ⅱ，Ⅳ型黏液細胞密度均低于吐溫80組，且DEP質量濃度越高，Ⅱ，Ⅳ型黏液細胞密度降幅越大.

表2還顯示，各DEP處理組，前腸Ⅱ型黏液細胞密度及較高質量濃度組（2，8mg／L組）Ⅰ，Ⅳ型黏液細胞密度與吐溫80組相比均有不同幅度的降低，且8mg／L組降幅最大.前腸各DEP處理組Ⅲ型黏液細胞密度及較低質量濃度組（0.125，0.5mg／L組）Ⅰ，Ⅳ型黏液細胞密度與吐溫80組相比均有不同幅度的增大.從表2還可看出，中腸0.125，0.5mg／L組Ⅰ型黏液細胞密度，中腸0.125mg／L組Ⅲ型黏液細胞密度及各DEP組Ⅱ型黏液細胞密度均高于吐溫80組，而較高質量濃度組（2，8mg／L組）Ⅰ，Ⅲ型黏液細胞密度及各DEP組Ⅳ型黏液細胞密度均低于吐溫80組.后腸0.125，0.5，2mg／L組Ⅰ型黏液細胞密度，后腸0.125，0.5mg／L組Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞密度均高于吐溫80組，而后腸8mg／L組Ⅰ型黏液細胞密度，后腸2，8mg／L組Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞密度及各DEP組Ⅱ型黏液細胞密度與吐溫80組相比均有不同幅度的降低.說明，一定劑量的DEP均能引起鰓絲及消化道各類型黏液細胞密度的變化，這種變化因DEP質量濃度不同、鰓絲及消化道部位不同而異.較高質量濃度的DEP能顯著降低鰓絲及消化道黏液細胞的密度，鰓絲、口腔上皮、前腸、后腸黏液細胞密度的降低主要是由于Ⅱ，Ⅳ型黏液細胞密度的降低所致，中腸黏液細胞密度的降低主要是由于Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞密度的降低所致.

3 討論

由魚類的黏液細胞分泌的黏液組成的黏液性免疫系統(tǒng)，被認為是魚類的第二免疫系統(tǒng)，同哺乳類分泌性免疫系統(tǒng)相似［11］，具有抵制病菌、寄生蟲侵襲，抑制病毒復制，形成機械屏障、化學屏障，保護自身等重要作用.此外，分布于消化道的黏液細胞分泌的黏液還有助于魚類獲取食物及吞咽，調節(jié)胃中pH值及助消化等作用［12］.安利國等［13］認為含中性黏多糖的Ⅰ型黏液細胞和含酸性黏多糖的Ⅱ型黏液細胞為幼稚型，同時含有酸性和中性黏多糖的Ⅲ型、Ⅳ型黏液細胞為成熟型.本實驗研究表明，較低質量濃度的DEP，鰓絲及消化道黏液細胞密度與吐溫80組相比無顯著性差異，但能使鰓絲、口腔上皮、前腸、后腸Ⅱ型，中腸Ⅳ型黏液細胞的密度有不同幅度的減小，能使鰓絲、口腔上皮、中腸Ⅰ，Ⅲ型、前腸、后腸Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞密度有不同幅度的增加，說明較低質量濃度的DEP能誘導Ⅰ型黏液細胞的增殖，抑制Ⅱ型黏液細胞的發(fā)生（中腸除外），促進Ⅰ，Ⅱ型向Ⅲ型或Ⅳ型轉化.原因可能與4種黏液細胞所含黏多糖的性質，DEP的毒性性質及所處的環(huán)境，如鰓絲、口腔上皮直接暴露于水體，前腸腸腔內為酸性環(huán)境等有關，是魚類對不良環(huán)境的一種保護性適應［12］.較高質量濃度的DEP均能顯著降低鰓絲及消化道黏液細胞的密度，這種密度的降低與各類型黏液細胞密度的變化也密切相關，8mg／L組除前腸Ⅲ型、中腸Ⅱ型黏液細胞密度高于吐溫80組外，其余各部位各類型黏液細胞密度均低于吐溫80組，但從表1、表2可發(fā)現(xiàn)，較高質量濃度的DEP組，鰓絲、口腔上皮、前腸、后腸黏液細胞密度的降低主要是由于Ⅱ，Ⅳ型黏液細胞密度的降低所致，中腸黏液細胞密度的降低主要是由于Ⅲ，Ⅳ型黏液細胞密度的降低所致.原因可能是較高質量濃度的DEP引起了相應類型黏液細胞的退化分解［14］，也可能與基因的表達有關，有研究表明［15－16］杯狀細胞的數(shù)目及其分泌的糖蛋白的物理化學性質可能受基因控制.目前，DEP對魚類各類型黏液細胞密度的影響機理尚不清楚，有待進一步深入研究.

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