李海鷹，楊文智，王苗苗，田嬌，申世剛

（1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002；2.河北大學藥學院，河北保定 071002）

水楊酸是治療痤瘡的重要藥物，現(xiàn)有上市治療痤瘡的含水楊酸非處方藥，是皮膚科常用藥［1］，氯霉素屬廣譜抗菌劑，可用于治療各種感染，水楊酸與氯霉素制成的復方制劑臨床用于治療脂溢性毛囊炎、皮炎和痤瘡［2－4］.涂膜劑是將藥物溶解或混合在成膜材料的揮發(fā)性溶液中所制得的外用液體制劑，具有工藝簡單、無需特殊設(shè)備、使用方便、容易清洗、不污染衣物的優(yōu)點［5］.普魯蘭糖成膜性、阻氣性、可塑性、粘性均較強，易溶于水、無毒、無色無味，廣泛用于醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域［6］.普魯蘭糖符合涂膜劑基質(zhì)的要求，但未見用作涂膜劑基質(zhì)的報道.本文嘗試制備水－氯普魯蘭糖涂膜劑（SACPP）［7］，考察涂膜劑中氯霉素體內(nèi)外釋放過程，為指導水－氯普魯蘭糖涂膜劑設(shè)計及應用提供必要的參考.

1 儀器與試藥

FL2200高效液相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）；Franz立式雙室擴散池（中科院上海有機所）；B－629型超聲波美容儀（15W，50～60Hz，吳邦美容美發(fā)設(shè)備有限公司）；SK－1快速混勻器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；TGL－16離心機（上海安亭科學儀器廠）.

10Ku普魯蘭糖（上海普奧生物科技有限公司，食品級）；聚乙烯醇（PVA17－88）（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水楊酸（天津市北辰驊躍化學試劑廠）；氯霉素（安徽省阜陽眾誠藥業(yè)有限公司）；丙三醇（天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；氮酮（福建壽寧美菲思生物化學品廠）；其余試劑均為分析純.

實驗動物：18～22g雄性昆明種小鼠（合格證號：1003008）和1.5～2.0kg新西蘭兔（合格證號：1005009）均由河北省實驗動物中心提供.

水－氯普魯蘭糖涂膜劑［7］：稱取普魯蘭糖0.75g和PVA17－880.375g，加去離子水40mL，浸泡加熱使其溶解，加入12mL丙三醇混合均勻，得到空白涂膜液.稱取3g水楊酸和3g氯霉素，用乙醇溶解，加入0.01g EDTA－2Na和1mL氮酮，混勻后加入到空白基質(zhì)中，加熱攪拌至完全溶解，趁熱加入一定量乙醇，得到均勻的白色溶液，放置室溫，以少量乙醇定容至100mL，即得白色水－氯普魯蘭糖涂膜劑.采用“2.1.2節(jié)”色譜條件測定氯霉素質(zhì)量分數(shù)，批號為20100505，20100506，20100507的涂膜劑中氯霉素的質(zhì)量分數(shù)分別為101.2%，99.8%和100.9%.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的確定

用乙醇配制適當質(zhì)量濃度的氯霉素和空白基質(zhì)溶液，過濾，取續(xù)濾液在200～500nm內(nèi)，以乙醇為空白進行波長掃描.綜合考慮氯霉素與水楊酸的最大吸收波長，最終確定氯霉素檢測波長為300nm，空白基質(zhì)無干擾.

色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm），分析柱前接ODS C18保護柱；流動相：甲醇－水（V（甲醇）∶V（水）＝50∶50），磷酸調(diào)pH至3.0；流速：1.0mL／min；檢測波長：300nm；進樣量：20μL.

2.2 體外透皮釋放實驗

2.2.1 實驗方法

采用立式雙室擴散池作滲透實驗裝置，有效透過面積為2.69cm2，接收池體積為13.0mL.將離體鼠皮角質(zhì)層朝向涂膜劑溶液，固定于立式雙室擴散池，保證接受液與鼠皮另一側(cè)充分接觸.精密量取自制涂膜劑2mL，含氯霉素60mg，均勻涂敷鼠皮上，系統(tǒng)控溫（32±0.5）℃，以磁力攪拌的生理鹽水做接收液.分別于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24h從接收池中精密移取1mL接收液，立即補充等量（32±0.5）℃生理鹽水，測定接收液中不同時間點的氯霉素含量.按下式計算氯霉素的單位面積累積滲透量（Q），其中V為擴散池接收室的體積，ρn為第n次取樣時接收液的質(zhì)量濃度，ρi為第i次取樣時接收液的質(zhì)量濃度，Vi為取樣量，A為有效透過面積.

2.2.2 標準曲線的建立

將氯霉素在丙酮中重結(jié)晶，干燥至恒重.精密稱取氯霉素，用甲醇配成1.25mg／mL的氯霉素儲備液.精密量取儲備液配成不同質(zhì)量濃度的標準溶液，按“2.1項”下方法進行分析，以峰面積A對質(zhì)量濃度ρ（μg／mL）作圖，得到氯霉素標準曲線為Y＝5.08×104ρ＋2.61×103，線性為0.25～20μg／mL（r＝0.999 5，n＝9）.涂膜劑基質(zhì)和透皮釋放液中成分對氯霉素測定均無影響，氯霉素保留時間為6.4min.

2.2.3 精密度和回收率實驗

取一定濃度的氯霉素對照品溶液，每隔3h進行測定，連續(xù)測定5次.相同條件下連續(xù)測定5d，其日內(nèi)和日間RSD值分別為1.4%和2.1%（n＝5）.在制備的涂膜劑中分別添加高、中、低3種質(zhì)量濃度的氯霉素標準溶液，每種質(zhì)量濃度各5份，處理后進行分析測定，計算回收率.氯霉素平均回收率為102.5%.以上結(jié)果表明：建立的色譜法可準確測定氯霉素體外透皮釋放含量，方法可靠.

2.2.4 體外透皮實驗結(jié)果

3.1 年齡與受教育程度 執(zhí)行功能受年齡及教育程度的廣泛影響，引起學者的極大關(guān)注。王靜[26]采用威斯康星卡分類測驗及TM評估重度抑郁顯示執(zhí)行功能損害與受教育年限有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，首發(fā)抑郁癥患者年齡越大、發(fā)病年齡越早，執(zhí)行功能損害越明顯；教育年限越長，工作記憶保持功能越好[27]。張玉欣等[28]發(fā)現(xiàn)抑郁癥中年齡與執(zhí)行功能呈負相關(guān)，受教育年限與其呈正相關(guān)。因此，提高教育程度是減少執(zhí)行功能損害的有效途徑。

依公式計算氯霉素的單位面積累積滲透量Q，將Q對時間t作圖，結(jié)果見圖1.氯霉素在6h內(nèi)釋放迅速，24h氯霉素累積透過百分率達到處方量的20%.

圖1 水－氯普魯蘭糖涂膜劑中氯霉素累積釋放曲線Fig.1 Chloramphenicol release profile of SACPP

以單位面積累積滲透量（Q）對時間（t）進行回歸分析，采用零級、一級和Higuchi方程進行擬合，結(jié)果見表1.水－氯普魯蘭糖涂膜劑中氯霉素體外釋放接近Higuchi方程，釋放緩慢.處方中選擇氮酮作為促滲劑，氮酮可改變脂質(zhì)雙分子層的致密性，增加脂質(zhì)流動性，降低藥物在角質(zhì)層和毛囊根鞘擴散阻力，促進藥物經(jīng)表皮細胞和毛囊途徑吸收［8］.乙醇可增強脂質(zhì)流動性［9］；甘油常用于協(xié)同促滲，故水－氯普魯蘭糖涂膜劑處方中甘油、乙醇和氮酮聯(lián)合促進氯霉素透皮吸收.實驗中采用離體小鼠鼠皮相同部位，以減少個體差異對藥物透皮的影響.

表1 水－氯普魯蘭糖涂膜劑中氯霉素累積滲透量與時間的擬合方程Tab.1 Correlation coefficients（r）for linear relationship over 24h release of model kinetics from fitting results for SACPP

2.3 兔體內(nèi)藥代動力學實驗

2.3.1 動物涂膜劑實驗

取健康新西蘭兔，雌雄各半，按給藥方式分為皮膚涂敷和超聲后皮膚涂敷2組，每組6只.于實驗前1周開始于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，實驗前禁食12h，可自由飲水.給藥前一天用脫毛膏去除兔背部兩側(cè)體毛，于正中至兩側(cè)劃出8cm×8cm區(qū)供皮涂用.將自制涂膜劑均勻涂敷于家兔的背部劃分區(qū)域，每側(cè)10mL.分別在0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，8，12和24h兔耳緣后靜脈叢取血，置肝素鈉抗凝離心管中.超聲組兔脫毛后表皮用醫(yī)用酒精濕潤，超聲探頭緊貼在濕潤兔表皮上進行間歇超聲，每超聲30s停2s，總共超聲10min，立即涂敷涂膜劑.采用kinetica軟件計算氯霉素在兔體內(nèi)的藥代動力學參數(shù).

2.3.2 血樣的處理

將抽取的血樣置含肝素鈉的試管中，離心處理后得到血漿.精密吸取血漿0.5mL，加入甲醇1.0mL，流動相0.3mL，渦旋混合器混勻，10 000r／min離心10min，吸取上清液0.6mL，置于50℃水浴中，用氮氣吹干，殘余物加0.1mL流動相溶解，10 000r／min離心10min，取上清液進行色譜分析.

2.3.3 標準曲線的建立

水－氯血樣的色譜圖如圖2所示.藥物峰形良好，分離完全，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對測定無干擾.用流動相配制不同質(zhì)量濃度的氯霉素對照品溶液，在0.5mL空白血樣中加入0.3mL不同質(zhì)量濃度氯霉素對照品溶液和1.0mL甲醇，依2.3.2項下處理后，進行色譜分析.血樣中氯霉素的標準曲線為：A＝3.21×104ρ＋1.80×10（r＝0.9884，n＝10），線性為0.025～1μg／mL.

圖2 HPLC色譜Fig.2 HPLC spectrum

2.3.4 精密度和回收率實驗

取一定質(zhì)量濃度的氯霉素血樣對照品溶液，每隔3h進行測定，連續(xù)測定5次.相同條件下連續(xù)測定5d，其日內(nèi)RSD為6.3%（n＝5），日間RSD為7.9%（n＝5）.在家兔空白血漿中分別添加0.3，0.75，1.5μg／mL的氯霉素標準液，每種質(zhì)量濃度各5份，處理后進行分析測定，計算回收率.高中低3種質(zhì)量濃度的回收率分別為（81.2±4.6）%，（85.4±6.1）%和（88.7±4.7）%，平均相對回收率85.1%.以上結(jié)果均符合生物樣品分析的要求.

2.3.5 兔藥代動力學實驗

表2為兔體內(nèi)氯霉素藥代動力學參數(shù)，藥代動力學曲線見圖3.兔表皮直接涂敷涂膜劑后，氯霉素1h達峰，質(zhì)量濃度為1.24μg／mL.經(jīng)超聲處理后，氯霉素達峰質(zhì)量濃度及時間未見明顯變化.氯霉素血藥質(zhì)量濃度達峰后，逐漸下降，12h后血中氯霉素的濃度已經(jīng)降至極低水平.超聲處理后氯霉素透皮吸收能力增強，體內(nèi)累積AUC比直接涂敷組大，超聲處理有利于氯霉素的透皮吸收.文獻報道氯霉素血藥濃度達到25μg／mL可導致人體毒性反應［10］，故檢測氯霉素制劑的體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度是評價其劑型安全性的必要工作.

表2 水－氯普魯蘭糖涂膜劑中氯霉素的兔體內(nèi)藥代動力學參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parmameters after using SACPP to rabbits

圖3 涂敷水－氯普魯蘭糖涂膜劑的兔體內(nèi)氯霉素藥－時曲線Fig.3 Mean plasma concentration－time curves（mean±SD）after using SACPP to rabbits.

2.4 體內(nèi)外相關(guān)性

以不同時間點下兔體內(nèi)氯霉素累積AUC（Y）對體外單位面積氯霉素累積滲透量（X）作圖，得回歸方程Y＝0.000 6X＋0.670 5，r＝0.982（n＝7），見表3.對相關(guān)系數(shù)進行顯著性檢查，計算統(tǒng)計量t＝r（n－2）1／2／（1－r2）1／2＝11.625，在顯著水平α＝0.001，自由度為6的條件下，查得t0.001（6）＝5.208，因為t＞t0.001（6），表明水－氯普魯蘭糖涂膜劑體內(nèi)外相關(guān)性顯著，通過研究涂膜劑中氯霉素的體外釋放可預測其體內(nèi)藥物吸收，實驗數(shù)據(jù)可為水－氯普魯蘭糖涂膜劑臨床應用提供參考.

表3 體內(nèi)外實驗不同時間下氯霉素的累積吸收Tab.3 Cumulative absorption of chloramphenicol at different time in vivo and in vitro

續(xù)表3Continue tab.3

3 結(jié)論

本文對自制的水－氯普魯蘭糖涂膜劑中氯霉素進行了體內(nèi)外透皮釋放研究，HPLC檢測方法準確，可靠.通過對離體鼠皮的體外透皮釋放實驗，氯霉素的體外釋放更符合Higuchi方程，可緩慢釋藥，24h累積釋放處方量的20%.兔皮經(jīng)間歇超聲處理后涂敷涂膜劑，可一定程度增大氯霉素的透皮吸收.水－氯普魯蘭糖涂膜劑體內(nèi)外釋放具有相關(guān)性，體外釋放可預測體內(nèi)藥物吸收，實驗數(shù)據(jù)可為水－氯普魯蘭糖涂膜劑臨床應用提供支持.

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