劉小萍，王莉，吳善東

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨過敏原蛋白的效果探究

劉小萍1，王莉1，吳善東2

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

目的采用改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨螨體中的蛋白，提高提取液的蛋白濃度和過敏原蛋白的效價(jià)。方法(1)細(xì)胞破碎：取樣品于研缽內(nèi)，液氮反復(fù)凍融4次，每次間隔10min，在研缽內(nèi)反復(fù)研磨凍融后的樣品。(2)蛋白提?。涸陔x心管中加入10m l Coca’s液，4℃勻速攪拌4 h后置于4℃冰箱過夜。(3)離心：4℃，5000×g離心1h，取上清液備用。(4)測(cè)提取蛋白的濃度：Bradford Reagent法測(cè)其提取蛋白的濃度。(5)SDS-PAGE電泳：參照Tricine-SDS-PAGE配制10%分離膠和4%濃縮膠，上樣10μL。(6)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行本研究獲得的提取液與進(jìn)口戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較。結(jié)果本研究中戶塵螨過敏原蛋白提取液的蛋白濃度為3.0mg/ml，遠(yuǎn)高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品的0.35mg/m l；且電泳圖顯示包含分子量為25kDa、14kDa的戶塵螨主要過敏原蛋白Der p 1、Der p 2條帶，蛋白濃度也高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品相應(yīng)的條帶；功能性實(shí)驗(yàn)中也表明本研究中戶塵螨過敏原蛋白提取液的免疫效價(jià)也顯著高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。結(jié)論可以用本研究的方法來(lái)大量提取戶塵螨過敏原蛋白，提取液可替代進(jìn)口產(chǎn)品，用作戶塵螨過敏原檢測(cè)試劑的生產(chǎn)原料或用于戶塵螨過敏原皮試、點(diǎn)刺及脫敏治療等，降低這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，進(jìn)而降低國(guó)內(nèi)戶塵螨過敏的診療費(fèi)用。

塵螨；提取方法；過敏原；ELISA

過敏性疾病(變態(tài)反應(yīng)疾病)被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是當(dāng)今世界性的重大衛(wèi)生問題。引發(fā)過敏性疾病是由于人體吸入、食入或接觸過敏原引起的，常見過敏多是I型超敏反應(yīng)，而引起I型超敏反應(yīng)的過敏原多為自然環(huán)境的蛋白質(zhì)[1]，其中，塵螨[2，3]是最常見的過敏原之一，塵螨引起的過敏性疾病占80%左右。在人們生活的環(huán)境中，塵螨幾乎無(wú)處不在，嚴(yán)重影響了塵螨致敏人群的生活質(zhì)量。因此，塵螨過敏的診斷和治療也變得尤為重要。除典型的臨床癥狀之外，查找過敏原是過敏性疾病治療和預(yù)防的關(guān)鍵，過敏原測(cè)定能夠幫助醫(yī)生確定患者出現(xiàn)的情況是否由過敏引起，同時(shí)確定是由何種過敏原引起的[4]。戶塵螨過敏的診斷方法主要有皮膚試驗(yàn)和體外試驗(yàn)兩種，皮膚試驗(yàn)的方法主要是點(diǎn)刺試驗(yàn)和皮內(nèi)試驗(yàn)，體外試驗(yàn)即是用體外診斷試劑檢測(cè)血液中的塵螨過敏原特異性抗體。脫敏治療則是戶塵螨過敏治療手段中最常用的方法之一。上述戶塵螨過敏的診斷和治療方法中均要用到戶塵螨過敏原蛋白作為免疫抗原。目前市面上質(zhì)量較好的戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品主要是以美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品、德國(guó)默克公司產(chǎn)品為代表的進(jìn)口產(chǎn)品，本文采用改進(jìn)的Coca’s液[5]提取戶塵螨螨體中的過敏原蛋白，以期能替代進(jìn)口產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備戶塵螨螨體(美國(guó)GREER公司)。碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、EDTA、DIECA。Uinco UV-2100型紫外分光光度計(jì)。美國(guó)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)。普朗DNM-9602酶標(biāo)分析儀。改進(jìn)的Coca’s液(自制)。美國(guó)ALLERMED Dust Mite Extracts(Dermatophagoides pteronyssinus 5000 AU/ m l)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞破碎取1g戶塵螨螨體，放入研缽中，加入液氮使液氮液面沒過樣品，在液氮揮發(fā)后，將樣品置于室溫10min，再次加入液氮，反復(fù)凍融4次。在研缽內(nèi)反復(fù)研磨凍融后的樣品，時(shí)間約10min。

1.2.2 蛋白提取將研磨后的樣品置于50m l離心管中，加入10ml改進(jìn)的Coca’s液(0.1M Na2CO3/ NaHCO3，0.1M NaCl，2mM EDTA，20mM DIECA，pH8.2)，加入磁懸浮粒子后，在4℃條件下勻速攪拌4 h后置于4℃冰箱過夜。

1.2.3 離心取出過夜的樣品，混勻后分裝于兩管10m l離心管中，平衡后在4℃，15000×g離心1h，取上清液備用。

1.2.4 測(cè)提取蛋白的濃度配制1ml Bradford Reagent+100μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+ 10μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+5μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+2μl蛋白上清液，其濃度分別代表原液，稀釋10倍、稀釋20倍、稀釋50倍。在紫外分光光度計(jì)595nm測(cè)其濃度。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)參照Tricine-SDS-PAGE配制10%分離膠和4%濃縮膠。10μl樣品+10μl loading buffer(2×)，混勻后加熱煮沸5min，冰上冷卻2min，外部加正極buffer，膠之間加負(fù)極buffer，上樣10～20μl，30V至染料進(jìn)入分離膠，改為90V至終點(diǎn)?？捡R斯亮藍(lán)工作液染色30min后用脫色液脫色至背景干凈。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。

1.2.6 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行本研究獲得的提取液與進(jìn)口戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較用本研究獲得的戶塵螨過敏原蛋白提取液和美國(guó)ALLERMED公司戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品以同樣的濃度0.5μg/m l、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ m l分別包被酶標(biāo)板，在上述包被的板孔中分別每孔加入陽(yáng)性血清50μl，輕輕混勻后37℃溫育45min，洗滌5次拍干，每孔加酶聯(lián)結(jié)合物100μl，置37℃溫育45min，洗滌5次后拍干，每孔加底物顯色液100μl，37℃顯色15min后加100μl終止液終止反應(yīng)，使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)每孔的OD值。

2 結(jié)果

2.1 戶塵螨過敏原蛋白濃度本研究用改進(jìn)的Coca’s液提取的戶塵螨過敏原蛋白濃度為3.0 mg/ m l，而美國(guó)ALLERMED公司生產(chǎn)的過敏原蛋白濃度為0.35mg/ml，可見本研究所得蛋白濃度約為美國(guó)ALLERMED的9倍。

2.2 戶塵螨過敏原蛋白電泳結(jié)果本研究獲得的戶塵螨過敏原蛋白提取液和美國(guó)ALLERMED公司的戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示，可以看出兩種過敏原蛋白提取液中均含有25kDa、14kDa的戶塵螨主要過敏原蛋白Der p 1、Der p 2條帶，且本研究獲得的戶塵螨過敏原蛋白提取液中的各分子量的戶塵螨過敏原蛋白濃度高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。

圖1 戶塵螨過敏原蛋白SDS-PAGE

2.3 本研究獲得的提取液與進(jìn)口過敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較本研究獲得的戶塵螨過敏原蛋白和美國(guó)ALLERMED戶塵螨過敏原蛋白以相同的濃度包被酶標(biāo)板后進(jìn)行同步ELISA試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，可見本研究的提取物效價(jià)明顯高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。

表1 戶塵螨過敏原提取液的功能比較

3 討論

戶塵螨過敏原蛋白提取的方法有很多[6]，例如傳統(tǒng)的Coca’s液、PBS提取液、裂解液及Trizol試劑等。本研究利用改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨螨體的過敏原蛋白，經(jīng)與美國(guó)ALLERMED公司的戶塵螨過敏原蛋白產(chǎn)品比較，獲得的提取液蛋白濃度較高，包含戶塵螨主要過敏原蛋白組分，且比購(gòu)買的戶塵螨過敏原蛋白效價(jià)更高，因此，可以用本研究的方法來(lái)大量提取戶塵螨過敏原蛋白，提取液可替代進(jìn)口產(chǎn)品，用作為戶塵螨過敏原檢測(cè)試劑的生產(chǎn)原料或用于戶塵螨過敏原皮試、點(diǎn)刺及脫敏治療等，降低這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，進(jìn)而降低國(guó)內(nèi)戶塵螨過敏的診療費(fèi)用。

[1]于國(guó)芳,譚立明,李華,等.吸入性變應(yīng)原檢測(cè)對(duì)診斷過敏性疾病的臨床應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):230-232.

[2]孫勁旅,張宏譽(yù),陳軍,等.塵螨與過敏性疾病的研究進(jìn)展[J].北京醫(yī)學(xué),2004,26(3):199-201.

[3]羅臣,肖小芹.塵螨引起的疾病及其防治研究進(jìn)展[J].湖南中藥學(xué)導(dǎo)報(bào),2004,10(9):61-62.

[4]黃凱,柯江維,王曄.南昌地區(qū)兒童過敏原IgE抗體體外檢測(cè)結(jié)果與分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):291-293.

[5]Hauck PR,Williamson S.The manufacture of allergenic extracts in North America[J].Clin Rev Allergy Immunol,2001,2(1):93-110.

[6]孫勁旅,張宏譽(yù),應(yīng)萬(wàn)濤,等.利用雙向電泳比較3種提取戶塵螨蛋白的方法[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,24(3):321-326.

R392.8,R593.1,R446.62

A

1674-1129(2013)05-0454-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.019

江西省萍鄉(xiāng)市科技局資助課題(編號(hào)：萍科字2011-58)

劉小萍，女，1966年12月生，大學(xué)本科學(xué)歷，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主攻臨床免疫學(xué)。