張才成，陳 靜，陳唐勇，章登珊，鄭曉豐，李俊明

(1、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、江西護理職業(yè)技術學院，江西南昌330006)

mTOR特異性siRNA重組表達載體的構建及鑒定

張才成1，陳 靜2，陳唐勇1，章登珊1，鄭曉豐1，李俊明1

(1、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、江西護理職業(yè)技術學院，江西南昌330006)

目的構建mTOR siRNA重組表達載體，為探討RNA干擾技術抑制巨噬細胞mTOR基因的相關研究奠定基礎。方法設計具有短發(fā)夾結構的DNA序列,經(jīng)退火成互補雙鏈,再克隆至載體pGPU6/GFP/Neo中構建重組表達載體,轉化DH5α菌株,提取質粒行酶切鑒定后,并進行序列測定。再轉染入巨噬細胞RAW264.7,進行熒光攝像和陽性克隆篩選。Western blot方法檢測巨噬細胞mTOR蛋白表達。結果DNA測序結果及PCR鑒定證實成功構建小鼠mTOR siRNA重組表達載體。Western blot結果顯示轉染該重組載體的巨噬細胞mTOR蛋白表達下降約41%。結論mTOR靶向RNA干擾重組表達載體構建成功,可以進行穩(wěn)定篩選，該載體對巨噬細胞mTOR蛋白表達有抑制作用。

mTOR;RNA干擾;重組表達載體

哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作為一種重要的信號傳導分子,參與細胞多種生理和病理過程,調節(jié)多種生物化學過程,對基因的轉錄調控發(fā)揮重要作用[1]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術已經(jīng)成為基因功能研究中非常重要的工具，為研究某些基因功能提供了重要的手段。為此,我們設計構建并篩選了針對mTOR的siRNA重組表達載體，為進一步研究mTOR調控內源性巨噬細胞，促進巨噬細胞殺滅胞內病原體奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料限制性內切酶、連接酶、質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒等主要試劑為Promega公司和寶生物公司產(chǎn)品；轉染試劑盒購自Invitrogen公司；Western Blot試劑為Santa Cruz公司產(chǎn)品(包括兔抗鼠單克隆一抗和HRP結合的山羊抗兔二抗等)；siRNA寡核苷酸序列和PCR引物合成及測序由上海生工公司完成；小鼠巨噬細胞RAW264.7和質粒pGPU6/GFP/Neo本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設計與合成在GenBank中查到小鼠mTOR基因的mRNA序列,通過Invitrogen公司在線軟件設計siRNA寡核苷酸序列及其互補的反義鏈。loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。反義片段以后接TTTTTT,以終止轉錄。正義鏈模板的5'端添加了CACC,與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補;反義鏈模板的5'端添加了GATC,與Bam HⅠ酶切后形成的黏端互補。使用Blaster軟件進行比對,以確定siRNA序列對靶基因具有特異性。設計的siRNA序列為:5'-CACCGCTGATCCTCAACGAGCTAGTTTCAAGAGA ACTAGCTCGTTGAGGATCAGCTTTTTTG-3',5'-

GATCCAAAAAAGCTGATCCTCAACGAGCTAGTTC TTGAAACTAGCTCGTTGAGGATCAGC-3'，生工合成。

1.2.2 載體構建首先將siRNA兩條互補的寡核苷酸片段進行退火反應以形成雙鏈DNA即模板鏈，具體條件為：95℃5min,70℃10min,后緩慢降溫至30℃,并維持30 min,再緩慢降溫至4℃。PGPU6/GFP/NEO質粒載體經(jīng)BbsI和BamHⅠ限制性內切酶雙酶切形成線性化載體,后經(jīng)瓊脂糖凝膠(10g/L)電泳,并使用DNA凝膠回收試劑盒回收線性載體。線性化PGPU6/GFP/NEO載體和模板鏈經(jīng)T4 DNA連接酶連接形成重組載體,命名為pGTE。

1.2.3 重組載體篩選鑒定重組載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(TSS法制備感受態(tài)細胞：大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中振搖至A600nm為0.3～0.4，取1 ml菌液，4℃1 000 r/min離心10min，將菌體重懸于100μl TSS液中。然后將上述重組載體加入感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，加入500μl LB培養(yǎng)基, 37℃振蕩培養(yǎng)1 h，最后將菌液均勻涂布于LB平板上),篩選陽性克隆,搖菌過夜,使用質粒提取試劑盒提取重組質粒載體，酶切鑒定并測序。

1.2.4 轉染小鼠巨噬細胞RAW264.7在含100ml/ L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，以24孔板置37℃，50ml/L CO2培養(yǎng)，生長匯合率達70%～80%的細胞進行轉染。采用Invitrogen公司推薦的Lipofectamine 2000轉染方法進行轉染。

1.2.5 轉染后mTOR蛋白表達水平鑒定收集細胞并提取細胞總蛋白，采用Western blot方法檢測mTOR蛋白表達，操作步驟按試劑盒說明書進行。使用Umax Astra 2100S掃描儀掃描膠片，并使用ImageQuant5.2軟件分析條帶。

2 結果

2.1 Bam HⅠ和PstⅠ內切酶單酶切重組質粒由于質粒pGPU6/GFP/Neo中PstⅠ酶切位點位于Bam HⅠ和BbsⅠ酶切位點之間，當插入目的基因片段之后,PstⅠ酶切位點消失，因此重組質粒不能被PstⅠ內切酶所酶切。故PstⅠ酶切結果為兩條帶,第一條為超螺旋的SC構型,第二條為質粒松弛開環(huán)的OC構型,從而證實重組質粒不能被PstⅠ酶切。但重組質?？杀籅am HⅠ單酶切而呈線性化,條帶為5100 bp左右。見圖1。重組質粒經(jīng)測序證實，見圖2。

圖1 真核表達質粒pGTE鑒定圖

圖2 真核表達質粒pGTE部分測序結果

2.2 成功轉染入巨噬細胞編碼siRNA的pGTE重組載體帶有綠色熒光蛋白，故轉染入巨噬細胞在綠色熒光激發(fā)下細胞可顯示為綠色(圖3),轉染后24 h熒光顯微鏡攝片證實轉染成功。

圖3 pGTE轉染巨噬細胞后綠色熒光蛋白表達情況(轉染24h)

2.3 Western blot檢測巨噬細胞中mTOR蛋白的表達Western blot檢測結果顯示,各組內參照βactin顯影條帶均一,但mTOR顯影條帶密度有差異，見圖4。電泳條帶灰度值經(jīng)軟件分析，結果為轉染重組質粒pGTE的巨噬細胞mTOR蛋白表達量較未轉染細胞下降約41%。

圖4 pGTE抑制mTOR蛋白效果鑒定圖

3 討論

巨噬細胞(macrophage,MΦ)源自單核細胞，后由血液進入組織器官分化而成。MΦ是機體天然免疫的重要細胞，對感染能夠發(fā)生迅速的反應，既能直接吞噬、殺滅病原體從而發(fā)揮非特異性免疫應答，又能作為抗原提呈細胞對抗原進行攝取、加工、處理并呈遞給Th細胞，從而啟動特異性免疫應答反應，進而將天然免疫和適應性免疫聯(lián)系起來，因些MΦ在抗感染免疫中有非常重要的作用。

一般情況下，病原微生物被MΦ吞噬后會很快被殺滅，但少數(shù)胞內寄生菌如結核分枝桿菌(Mtb)、沙門菌、布魯菌等可通過抑制巨噬細胞內吞噬體與溶酶體的融合、降低MΦ對其抗原呈遞的能力進而抑制機體的獲得性免疫等機制，使其能在MΦ內長期存活形成持留，從而造成潛伏感染[2]。我國為結核病高負擔國家之一，潛伏感染、多耐藥菌株以及免疫低下人群的合并感染[3,4]是目前困擾結核病防治工作的突出問題。

近年來不斷有研究證實自噬可以促進巨噬細胞清除胞內寄生菌[5]。因此如何提高MΦ自噬水平以達到清除胞內存活病原菌成了結核病研究的一個新熱點。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin, TOR)(哺乳動物為mTOR)在自噬中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用。針對該信號通路選擇抑制性藥物治療腫瘤已經(jīng)取得較為滿意的效果[6,7]。有研究在體外細胞培養(yǎng)中使用mTOR蛋白抑制劑雷帕霉素上調MΦ自噬水平取得了較好的抗Mtb效果[8,9]。由于雷帕霉素及其衍生物均為免疫抑制劑，不適于結核病的治療，而且藥物的毒副作用也顯而易見，因此通過siRNA沉默mTOR基因用于清除胞內存活的Mtb可能是更為直接和有效的方法。

RNAi是由同源雙鏈RNA引發(fā)特異性mRNA發(fā)生降解的一種轉錄后基因沉默現(xiàn)象[10]，能夠對靶基因表達實現(xiàn)特異、高效地抑制。作為2002年十大科學進展之首，目前RNAi技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤和感染性疾病的基因治療，并且已顯示出很好的應用潛能。

本研究使用的質粒pGPU6/GFP/Neo包含U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動子,利用較為單一的啟動子和終止序列產(chǎn)生大量的小RNA。同時,在啟動子下游插入的siRNA可以在RNA干擾質粒進入宿主細胞并表達后,單鏈的RNA配對形成短的雙鏈RNA,從而引發(fā)RNA干擾。而且,該質粒載體含有卡那耐藥基因,有利于陽性重組子的克隆篩選。我們在本實驗所構建的重組載體中含有綠色熒光蛋白基因,其表達產(chǎn)物-綠色熒光蛋白,可以很方便地使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測,從而確定載體轉染效率。我們根據(jù)GenBank中mTOR基因的核苷酸序列,根據(jù)RNA干擾序列的設計原則設計出阻斷mTOR基因表達的干擾序列,并成功克隆至載體pGPU6/GFP/Neo,經(jīng)過抗性輔助篩選,重組質粒被整合到宿主細胞基因組后,RNA干擾效應可以實現(xiàn)傳代。

我們進一步對重組質粒轉染巨噬細胞后對mTOR蛋白表達的影響進行了分析。Western blot檢測結果顯示轉染pGTE的巨噬細胞mTOR蛋白表達下降了約41%，說明該重組質粒對巨噬細胞mTOR基因沉默是有效果的。這也為進一步研究mTOR基因沉默在巨噬細胞清除胞內寄生的Mtb以及探索結核病的基因治療奠定了一些實驗基礎。同時該真核表達質粒也可用于巨噬細胞內其它寄生菌殺滅的相關研究。

[1]Fingra DC,Richardson CJ,Tee AR,et a.l mTOR controls cell cycle progression through its cell growth effectors S6K1 and 4E2BP1/ eukaryotic translation initiation factor 4E[J].Mol Cell Biol,2004, 24(1):200-216.

[2]MicKinney JD,Sacchettini JC,et al.Persistence of mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase[J].Nature,2000,406(6797):735-738.

[3]王前,鄭磊.結核分枝桿菌喹諾酮類耐藥基因研究進展[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2012,30(2):103-105.

[4]胡冬華,歐陽福桂,李鷹.耐多藥結核桿菌對二線抗結核藥物的敏感性實驗研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(6):543-545.

[5]劉云霞,張萬江.結核分枝桿菌與巨噬細胞相互作用的研究進展[J].中國細胞生物學學報,2012,34(6):617-622.

[6]Altman JK，Yoon P，Katsoulidis E，et al．Regulatory effects of mammalian target of rapamycin-mediated signals in the generation of arsenic trioxide responses[J]．J Biol Chem，2008，283(4):1992-2001．

[7]Sinnberg T，Lasithiotakis K，Niessner H，et al．Inhibition of PI3KAKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide[J]．J Invest Dermatol，2009，129(6):1500-1515．

[8]Floto RA,Sarkar S,Perlstein EO,et al.Small molecule enhancers of rapamycin-induced TOR inhibition promote autophagy,reduce toxicity in Huntington’s disease models and enhance killing of mycobacteria by macrophages[J].Autophagy,2007,3(6),620-622.

[9]Vergne I,Singh S,Roberts E,et al.Autophagy in immune defense against mycobacterium tuberculosis[J].Autophagy,2006,2(3),175-178.

[10]Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [J].Nature,1998;391(6669):806-811.

Construction and identification of mTOR specific siRNA recombinant expression vector

ZHANG Caicheng,CHEN Jing,CHEN Tangyong,et al.Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Nanchang University,Nanchang 330006 China.

Objective To construct mTOR specific siRNA recombinant expression vector and provide foundation to inhibit macrophage mTOR gene by intenferenc.Methods Short hairpin DNA sequence was annealed to form double chain,then cloned into vector pGPU6/GFP/Neo to construct the recombinant expression vector,and then transformed into DH5α strain.Plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing,and transfected into macrophage RAW264.7.Fluorescence imaging and positive clones were screened after plasmid transfection.Expression of mTOR protein in macrophage was detected by western blot method.Results DNA sequencing and PCR analysis confirmed that mice mTOR siRNA recombinant expression vector was constructed successfully.Western blot results showed that the expression of mTOR protein in macrophage that be transfected with the recombinant vector decreased by 41%.Conclusion RNA interference targeting mTOR recombinant expression vector was successfully constructed,and could be stabilized filter.The vector had inhibitory effect on mTOR expression in macrophage.

mTOR;RNA interference;Recombinant expression vector

Q522,Q344+.13

A

1674-1129(2013)06-0521-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.06.003

國家自然科學基金(30901284)，江西省自然科學基金(2009GQY0203)

張才成，男，37歲，主管技師，主要從事感染性疾病的臨床檢驗及研究工作。