張才成，陳 靜，陳唐勇，章登珊，鄭曉豐，李俊明

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；2、江西護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330006)

mTOR特異性siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

張才成1，陳 靜2，陳唐勇1，章登珊1，鄭曉豐1，李俊明1

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；2、江西護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330006)

目的構(gòu)建mTOR siRNA重組表達(dá)載體，為探討RNA干擾技術(shù)抑制巨噬細(xì)胞mTOR基因的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列,經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈,再克隆至載體pGPU6/GFP/Neo中構(gòu)建重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化DH5α菌株,提取質(zhì)粒行酶切鑒定后,并進(jìn)行序列測(cè)定。再轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞RAW264.7,進(jìn)行熒光攝像和陽(yáng)性克隆篩選。Western blot方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)。結(jié)果DNA測(cè)序結(jié)果及PCR鑒定證實(shí)成功構(gòu)建小鼠mTOR siRNA重組表達(dá)載體。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染該重組載體的巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)下降約41%。結(jié)論mTOR靶向RNA干擾重組表達(dá)載體構(gòu)建成功,可以進(jìn)行穩(wěn)定篩選，該載體對(duì)巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)有抑制作用。

mTOR;RNA干擾;重組表達(dá)載體

哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子,參與細(xì)胞多種生理和病理過程,調(diào)節(jié)多種生物化學(xué)過程,對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用[1]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)已經(jīng)成為基因功能研究中非常重要的工具，為研究某些基因功能提供了重要的手段。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建并篩選了針對(duì)mTOR的siRNA重組表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究mTOR調(diào)控內(nèi)源性巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺滅胞內(nèi)病原體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料限制性內(nèi)切酶、連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒等主要試劑為Promega公司和寶生物公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Western Blot試劑為Santa Cruz公司產(chǎn)品(包括兔抗鼠單克隆一抗和HRP結(jié)合的山羊抗兔二抗等)；siRNA寡核苷酸序列和PCR引物合成及測(cè)序由上海生工公司完成；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設(shè)計(jì)與合成在GenBank中查到小鼠mTOR基因的mRNA序列,通過Invitrogen公司在線軟件設(shè)計(jì)siRNA寡核苷酸序列及其互補(bǔ)的反義鏈。loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)。反義片段以后接TTTTTT,以終止轉(zhuǎn)錄。正義鏈模板的5'端添加了CACC,與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ);反義鏈模板的5'端添加了GATC,與Bam HⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ)。使用Blaster軟件進(jìn)行比對(duì),以確定siRNA序列對(duì)靶基因具有特異性。設(shè)計(jì)的siRNA序列為:5'-CACCGCTGATCCTCAACGAGCTAGTTTCAAGAGA ACTAGCTCGTTGAGGATCAGCTTTTTTG-3',5'-

GATCCAAAAAAGCTGATCCTCAACGAGCTAGTTC TTGAAACTAGCTCGTTGAGGATCAGC-3'，生工合成。

1.2.2 載體構(gòu)建首先將siRNA兩條互補(bǔ)的寡核苷酸片段進(jìn)行退火反應(yīng)以形成雙鏈DNA即模板鏈，具體條件為：95℃5min,70℃10min,后緩慢降溫至30℃,并維持30 min,再緩慢降溫至4℃。PGPU6/GFP/NEO質(zhì)粒載體經(jīng)BbsI和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切形成線性化載體,后經(jīng)瓊脂糖凝膠(10g/L)電泳,并使用DNA凝膠回收試劑盒回收線性載體。線性化PGPU6/GFP/NEO載體和模板鏈經(jīng)T4 DNA連接酶連接形成重組載體,命名為pGTE。

1.2.3 重組載體篩選鑒定重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(TSS法制備感受態(tài)細(xì)胞：大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中振搖至A600nm為0.3～0.4，取1 ml菌液，4℃1 000 r/min離心10min，將菌體重懸于100μl TSS液中。然后將上述重組載體加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，加入500μl LB培養(yǎng)基, 37℃振蕩培養(yǎng)1 h，最后將菌液均勻涂布于LB平板上),篩選陽(yáng)性克隆,搖菌過夜,使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒載體，酶切鑒定并測(cè)序。

1.2.4 轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在含100ml/ L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，以24孔板置37℃，50ml/L CO2培養(yǎng)，生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Invitrogen公司推薦的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后mTOR蛋白表達(dá)水平鑒定收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot方法檢測(cè)mTOR蛋白表達(dá)，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。使用Umax Astra 2100S掃描儀掃描膠片，并使用ImageQuant5.2軟件分析條帶。

2 結(jié)果

2.1 Bam HⅠ和PstⅠ內(nèi)切酶單酶切重組質(zhì)粒由于質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo中PstⅠ酶切位點(diǎn)位于Bam HⅠ和BbsⅠ酶切位點(diǎn)之間，當(dāng)插入目的基因片段之后,PstⅠ酶切位點(diǎn)消失，因此重組質(zhì)粒不能被PstⅠ內(nèi)切酶所酶切。故PstⅠ酶切結(jié)果為兩條帶,第一條為超螺旋的SC構(gòu)型,第二條為質(zhì)粒松弛開環(huán)的OC構(gòu)型,從而證實(shí)重組質(zhì)粒不能被PstⅠ酶切。但重組質(zhì)粒可被Bam HⅠ單酶切而呈線性化,條帶為5100 bp左右。見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證實(shí)，見圖2。

圖1 真核表達(dá)質(zhì)粒pGTE鑒定圖

圖2 真核表達(dá)質(zhì)粒pGTE部分測(cè)序結(jié)果

2.2 成功轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞編碼siRNA的pGTE重組載體帶有綠色熒光蛋白，故轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞在綠色熒光激發(fā)下細(xì)胞可顯示為綠色(圖3),轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡攝片證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。

圖3 pGTE轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(轉(zhuǎn)染24h)

2.3 Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,各組內(nèi)參照βactin顯影條帶均一,但mTOR顯影條帶密度有差異，見圖4。電泳條帶灰度值經(jīng)軟件分析，結(jié)果為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGTE的巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞下降約41%。

圖4 pGTE抑制mTOR蛋白效果鑒定圖

3 討論

巨噬細(xì)胞(macrophage,MΦ)源自單核細(xì)胞，后由血液進(jìn)入組織器官分化而成。MΦ是機(jī)體天然免疫的重要細(xì)胞，對(duì)感染能夠發(fā)生迅速的反應(yīng)，既能直接吞噬、殺滅病原體從而發(fā)揮非特異性免疫應(yīng)答，又能作為抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行攝取、加工、處理并呈遞給Th細(xì)胞，從而啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而將天然免疫和適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來，因些MΦ在抗感染免疫中有非常重要的作用。

一般情況下，病原微生物被MΦ吞噬后會(huì)很快被殺滅，但少數(shù)胞內(nèi)寄生菌如結(jié)核分枝桿菌(Mtb)、沙門菌、布魯菌等可通過抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬體與溶酶體的融合、降低MΦ對(duì)其抗原呈遞的能力進(jìn)而抑制機(jī)體的獲得性免疫等機(jī)制，使其能在MΦ內(nèi)長(zhǎng)期存活形成持留，從而造成潛伏感染[2]。我國(guó)為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，潛伏感染、多耐藥菌株以及免疫低下人群的合并感染[3,4]是目前困擾結(jié)核病防治工作的突出問題。

近年來不斷有研究證實(shí)自噬可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)寄生菌[5]。因此如何提高M(jìn)Φ自噬水平以達(dá)到清除胞內(nèi)存活病原菌成了結(jié)核病研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin, TOR)(哺乳動(dòng)物為mTOR)在自噬中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。針對(duì)該信號(hào)通路選擇抑制性藥物治療腫瘤已經(jīng)取得較為滿意的效果[6,7]。有研究在體外細(xì)胞培養(yǎng)中使用mTOR蛋白抑制劑雷帕霉素上調(diào)MΦ自噬水平取得了較好的抗Mtb效果[8,9]。由于雷帕霉素及其衍生物均為免疫抑制劑，不適于結(jié)核病的治療，而且藥物的毒副作用也顯而易見，因此通過siRNA沉默mTOR基因用于清除胞內(nèi)存活的Mtb可能是更為直接和有效的方法。

RNAi是由同源雙鏈RNA引發(fā)特異性mRNA發(fā)生降解的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[10]，能夠?qū)Π谢虮磉_(dá)實(shí)現(xiàn)特異、高效地抑制。作為2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首，目前RNAi技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤和感染性疾病的基因治療，并且已顯示出很好的應(yīng)用潛能。

本研究使用的質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo包含U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子,利用較為單一的啟動(dòng)子和終止序列產(chǎn)生大量的小RNA。同時(shí),在啟動(dòng)子下游插入的siRNA可以在RNA干擾質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞并表達(dá)后,單鏈的RNA配對(duì)形成短的雙鏈RNA,從而引發(fā)RNA干擾。而且,該質(zhì)粒載體含有卡那耐藥基因,有利于陽(yáng)性重組子的克隆篩選。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)所構(gòu)建的重組載體中含有綠色熒光蛋白基因,其表達(dá)產(chǎn)物-綠色熒光蛋白,可以很方便地使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),從而確定載體轉(zhuǎn)染效率。我們根據(jù)GenBank中mTOR基因的核苷酸序列,根據(jù)RNA干擾序列的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出阻斷mTOR基因表達(dá)的干擾序列,并成功克隆至載體pGPU6/GFP/Neo,經(jīng)過抗性輔助篩選,重組質(zhì)粒被整合到宿主細(xì)胞基因組后,RNA干擾效應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)傳代。

我們進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后對(duì)mTOR蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了分析。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGTE的巨噬細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)下降了約41%，說明該重組質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞mTOR基因沉默是有效果的。這也為進(jìn)一步研究mTOR基因沉默在巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)寄生的Mtb以及探索結(jié)核病的基因治療奠定了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)該真核表達(dá)質(zhì)粒也可用于巨噬細(xì)胞內(nèi)其它寄生菌殺滅的相關(guān)研究。

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Construction and identification of mTOR specific siRNA recombinant expression vector

ZHANG Caicheng,CHEN Jing,CHEN Tangyong,et al.Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Nanchang University,Nanchang 330006 China.

Objective To construct mTOR specific siRNA recombinant expression vector and provide foundation to inhibit macrophage mTOR gene by intenferenc.Methods Short hairpin DNA sequence was annealed to form double chain,then cloned into vector pGPU6/GFP/Neo to construct the recombinant expression vector,and then transformed into DH5α strain.Plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing,and transfected into macrophage RAW264.7.Fluorescence imaging and positive clones were screened after plasmid transfection.Expression of mTOR protein in macrophage was detected by western blot method.Results DNA sequencing and PCR analysis confirmed that mice mTOR siRNA recombinant expression vector was constructed successfully.Western blot results showed that the expression of mTOR protein in macrophage that be transfected with the recombinant vector decreased by 41%.Conclusion RNA interference targeting mTOR recombinant expression vector was successfully constructed,and could be stabilized filter.The vector had inhibitory effect on mTOR expression in macrophage.

mTOR;RNA interference;Recombinant expression vector

Q522,Q344+.13

A

1674-1129(2013)06-0521-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.06.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(30901284)，江西省自然科學(xué)基金(2009GQY0203)

張才成，男，37歲，主管技師，主要從事感染性疾病的臨床檢驗(yàn)及研究工作。