劉 翼 李明慧 郭文佳 張國慶 龐作良

microRNA廣泛存在于真核生物中，與腫瘤的關(guān)系極為密切［1-3］。miR-10b作為miRNA家族中的成員之一，目前認(rèn)為其在多種實體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［4-5］。最近的研究表明，與良性腫瘤患者相比，肺癌患者中miRNA-10b的水平明顯升高，而且，他們發(fā)現(xiàn)血清中miRNA-10b的高表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［6］。本研究通過轉(zhuǎn)染表達(dá)miRNA-10b質(zhì)粒進(jìn)入人肺腺癌細(xì)胞株A549，觀察miRNA-10b對人肺癌增殖及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗所需細(xì)胞系和主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞株A549購于CCTCC(China Center for Type Culture Collection，中國典型培養(yǎng)物保藏中心);胎牛血清購自Gibco公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，miRNA-10b真核表達(dá)質(zhì)粒由紐恩(上海)生物科技有限公司提供;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;SYBRGreen PCR試劑盒購自Thermo公司;CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所;Transwell小室購于康寧公司。A549在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，設(shè)置成3個組，分別是:空白對照組，即未轉(zhuǎn)染組;陰性對照組，即空載體轉(zhuǎn)染組(NC序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT);miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體 lipofectamineTM 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染 siRNA，具體操作步驟:在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，將5 μl lipofectamineTM2000加入250 μl改良型必需基本培養(yǎng)基(opti-MEM)中，在室溫靜置5 min;5 μl的siRNA加入250 μl opti-MEM中;將二者混合，室溫放置20 min;吸去原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，更換成無血清、無抗生素的培養(yǎng)液，再加入siRNA和500 μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合液混勻;在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h后換成正常培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.1 檢測各組細(xì)胞中miRNA-10b的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RNA樣品用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，使用實時定量PCR法檢測樣本中miRNA-10b的相對表達(dá)量。特異性引物序列:miRNA-10b 上游引物:5＇GGATACCCTGTAGAACCGAA-3＇，下游引物:5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇;內(nèi)參 U6 上游引物:5＇-TGGGGTTATACATTGTGAGAGGA-3＇，下游引物:5 ＇-GTGTGCTACGGAGTTCAGAGGTT-3 ＇。 根 據(jù) 公 式R=2-△△Ct，計算目的基因相對含量。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖情況 將每塊板設(shè)置空白對照組、陰性對照組和miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞株，稀釋細(xì)胞［(1～5) ×104個細(xì)胞/ml培養(yǎng)液］，取 100 μl至96孔培養(yǎng)板，每組分為24、48和72 h 3個時間點，按1∶10體積比混合無血清必需基本培養(yǎng)基DMEM和Cell Counting Kit-8(CCK-8)，采用微板分光光度計測定450 nm波長吸光度。記錄數(shù)值，并制作細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 Transwell侵襲實驗 實驗前24 h將不同分組的細(xì)胞換成無血清DMEM培養(yǎng)基，接種前將transwell小室和24孔板用1×PBS浸泡5 min，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，接種到transwell小室內(nèi)，0.5 ml細(xì)胞懸液加入每個小室，0.75 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液加入下層的24孔板中，每組3復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，固定，染色，transwell小室內(nèi)沒有遷移的細(xì)胞用棉簽擦去，顯微鏡下觀察，計數(shù)每個視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果為3次重復(fù)試驗的平均值，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察，空白對照組未見綠色熒光，陰性對照組及miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)70%。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-10b的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，通過實時定量PCR檢測3組細(xì)胞中miRNA-10b的RQ平均值，結(jié)果顯示，miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中 miRNA-10b表達(dá)明顯上調(diào)(RQ=1.34±0.13)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而陰性對照組(RQ=0.96 ±0.07)與空白對照組(RQ=0.99 ±0.08)比較，miRNA-10b表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-10b表達(dá)水平的變化

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖情況

miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長速度高于空白對照組和陰性對照組細(xì)胞(P＜0.05)，而空白對照組和陰性對照組相比無明顯差異 (P＞0.05，圖2)。

圖2 miRNA-10b對人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖的影響

2.4 Transwell結(jié)果

miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯較空白對照組、陰性對照組有更多的細(xì)胞遷移到Transwell膜的另一側(cè)(P＜0.05)，而空白對照組與陰性對照組無明顯差異(P＞0.05)，說明轉(zhuǎn)染miRNA-10b真核表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。

3 討論

多種因素，如各種調(diào)控基因及細(xì)胞因子等，形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，影響腫瘤細(xì)胞的生長調(diào)控。環(huán)境影響基因突變、可遺傳的表觀遺傳學(xué)改變等都能夠影響細(xì)胞的生物學(xué)性狀。microRNA作為調(diào)控性的小分子RNA，在腫瘤中的作用越來越受到重視。最近的研究表明，microRNA自身的調(diào)控，尤其是表觀遺傳學(xué)層次的調(diào)控，不但影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，還對腫瘤的分期預(yù)后也具有相當(dāng)?shù)挠绊懠疤崾咀饔茫?-8］。

miR-10b定位于HOX基因簇，它的功能不僅僅是維持正常組織的增殖分化，還在腫瘤的發(fā)生及侵襲過程中發(fā)揮重要作用，有研究表明miR-10b促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［9-11］。我們的研究通過體外實驗，將表達(dá)miRNA-10b的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，獲得過表達(dá)miRNA-10b的A549細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果可以看出，miRNA-10b表達(dá)量增高的細(xì)胞增殖速度加快;我們通過transwell檢測了A549細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果提示:過表達(dá)MiRNA-10b可以增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲能力。

有研究表明，在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，多種miRNA都可作為抑癌基因或癌基因起調(diào)控作用。我們可以通過導(dǎo)入外源的有抑癌基因功能miRNA，或者采用多種方法下調(diào)或抑制有抑癌基因功能的miRNA的表達(dá)，起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長的作用［12］。我們通過研究認(rèn)為:miRNA-10b可以促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。我們有理由相信，隨著研究的進(jìn)一步深入，miRNA-10b靶基因及調(diào)控機(jī)制得以確定，miRNA-10b有可能成為肺癌治療的1個新的靶點。

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