史 欣 葉連紅 李東紅

本試驗?zāi)M卵巢癌細胞產(chǎn)生耐藥的過程，以米非司酮作為逆轉(zhuǎn)劑，在化療的同時同步使用，探討在沖擊法的紫杉醇誘導下，米非司酮能否抑制或減慢卵巢癌耐藥性的表達，并探討其作用機制、機理。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細胞系A(chǔ)2780、skov3:A2780購買于北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司(細胞由上海生物化學與細胞生物學研究所保存);skov3購買于青島醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研中心，分別置于37℃、相對濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，于含有10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 試劑和藥品

RPMI-1640及 DMEM購于 Gibco公司，紫杉醇Taxol(6 mg/ml)購自美國百時美施貴寶公司，米非司酮系浙江仙琚制藥股份公司生產(chǎn)，羅丹明(Rh123)購買于Sigma公司，鼠抗人MDR1單克隆抗體系購買于Boster公司，SP免疫組化試劑盒系購于北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

紫杉醇誘導A2780:取對數(shù)生長期的A2780，置于含有紫杉醇 (Taxol 0.2 μmol/ml)及10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中1 h后，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，換不含有Taxol 10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至細胞恢復對數(shù)生長，作為陽性對照;實驗組置于含有0.2 μmol/ml紫杉醇10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中，然后加入 1 μm 、2.5 μm、10 μm 米非司酮(RU486)作用1 h，各組均進行30次誘導;A2780直接傳代，以不加用紫杉醇誘導耐藥的作為陰性對照。

紫杉醇誘導skov3:同樣取對數(shù)生長期的skov3細胞，應(yīng)用含有1.5 μmol/ml紫杉醇 (Taxol)10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液作用1 h，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，然后換用不含有Taxol的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，至細胞恢復對數(shù)生長，作為陽性對照;實驗組分別置于1.5 μmol/ml紫杉醇的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，然后加入 1 μM、2.5 μM、10 μM 的米非司酮 (RU486)，同樣作用1 h，各組均進行30次誘導;同時以skov3直接傳代后不加紫杉醇的作為陰性對照。

細胞形態(tài)觀察及繪制生長曲線:取對數(shù)生長期各組細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞取5 000個/孔，放置于37℃、相對濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁生長后，每天取其中3孔細胞進行細胞計數(shù)，連續(xù)觀察8天，從而繪制各組細胞的生長曲線。

采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞半數(shù)致死濃度即IC50值。應(yīng)用流式細胞儀檢測各組細胞P-gp外排功能。

SP染色:應(yīng)用3%H2O2孵育已制好的細胞爬片10 min，封閉后依次滴加鼠抗人MDR1單克隆抗體(1∶50)，DAB顯色，復染，脫水，封片，最后觀察P-gp表達情況。

Western Blotting法:取對數(shù)生長期的各組細胞，用蛋白裂解液裂解細胞，檢測P-gp濃度后，以1∶4的比例加上樣緩沖液，沸水水浴5 min。采用SDS-多聚丙烯酰胺凝膠電泳法，PVC膜轉(zhuǎn)膜，以鼠抗人MDR1單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜，PBST 3次洗膜后加入二抗孵育2 h。重復上述PBST洗膜方法于暗室發(fā)光顯帶。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞誘導后的形態(tài)觀察

A2780細胞誘導前細胞生長良好，形態(tài)規(guī)則，透亮度好，貼壁生長后伸展成梭形。紫杉醇藥物誘導后，細胞變小，貼壁后細胞兩尖端變長，細胞有呈團簇狀生長的趨勢。加用米非司酮的各組細胞也呈現(xiàn)出上述特點，作用過程中米非司酮濃度高組細胞壞死情況越明顯，其恢復對數(shù)生長期的時間越長。skov3傳代及其實驗誘導耐藥的各組細胞均為貼壁生長，于光鏡下觀察，skov3邊界清晰，細胞呈梭狀，上皮樣生長，細胞折光性好。經(jīng)紫杉醇誘導后，大部分細胞發(fā)生壞死及凋亡，存活細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞變長、形態(tài)不規(guī)則，大小不一，邊界模糊。誘導過程中形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈不規(guī)則狀，突起增多，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細胞間隙較大。細胞畸形核多見，多伸出許多偽足，細胞質(zhì)顆粒明顯增多。胞質(zhì)內(nèi)則常有顆粒狀囊泡，突起增多。至恢復對數(shù)生長期時，細胞的形態(tài)又慢慢恢復。加米非司酮的各組細胞也呈現(xiàn)出上述特點，作用過程中米非司酮濃度高組細胞壞死情況越明顯，其恢復對數(shù)生長期的時間越長。

2.2 各組生長曲線

圖1 紫杉醇作用A2780后各組生長曲線

圖2 紫杉醇作用skov3后各組生長曲線

由圖1、圖2可見，紫杉醇誘導體外卵巢癌細胞系(A2780、skov3)，可以使細胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對不旺盛的亞群。加入米非司酮可以使這種篩選的傾向性更加明顯，米非司酮的濃度越高，篩選出的亞克隆生長越不活躍。

2.3 各組細胞紫杉醇24 h的半數(shù)致死濃度(IC50值)

A2780原代細胞 IC50:(0.061 ±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.082 ±0.003)μmol/ml;紫杉醇 +2.5 μM RU486 組 IC50:(0.096 ±0.004) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組 IC50:(0.110 ±0.003) μmol/ml;紫杉醇組 IC50:(0.127 ±0.008) μmol/ml。因此，應(yīng)用 0.2 μmol/ml紫杉醇誘導30次后:各組A2780細胞對紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780細胞對紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。使用米非司酮的各組與不使用的陽性對照組對紫杉醇耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。不同濃度米非司酮實驗組間對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且呈一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實驗組耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對地保持對紫杉醇的敏感性。

skov3原代細胞 IC50:(0.020±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.151 ± 0.011)μmol/ml;紫杉醇+2.5μM RU486 組 IC50:(0.237 ±0.027) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組IC50:(0.442 ±0.018) μmol/ml，紫杉醇組 IC50:(0.512±0.023) μmol/ml。因此，使用紫杉醇(Taxol)1.5 μmol/ml誘導skov3 30次后:各組skov3細胞對于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代skov3細胞對紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。米非司酮各組與不使用的陽性對照組對紫杉醇的耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。3組使用不同濃度米非司酮的實驗組間對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實驗組其耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對地保持對紫杉醇的敏感性(P＜0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測熒光強度

A2780組中A2780原代細胞熒光強度為(98.1±1.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(82.4 ±2.1);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(72.7 ±3.2);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(54.2 ±2.9);單用紫杉醇組為(46.6±2.1)。skov3組中skov3原代細胞熒光強度為(93.6±2.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(78.8 ±1.8);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(63.3 ±4.5);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(34.7 ±3.9)，單用紫杉醇組為(18.2±2.7)。因此，加入不同濃度米非司酮的誘導耐藥組與單純使用紫杉醇組熒光強度比較有顯著性差異(P＜0.05)。由此表明，不同濃度的米非司酮可以不同程度地增加羅丹明在A2780、skov3兩組細胞內(nèi)的蓄積。

2.5 免疫組化SP染色結(jié)果

P-gp在A2780、skov3原代細胞中均無表達;而在使用不同濃度米非司酮的各組細胞中均呈陽性表達;在單用紫杉醇誘導的A2780、skov3細胞中呈強陽性表達。

2.6 Western Blotting法檢測P-gp蛋白定量

經(jīng)過紫杉醇的誘導后，加入不同劑量的米非司酮組均呈現(xiàn)P-gp表達，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達量與誘導同時加入米非司酮的濃度呈負相關(guān)，即米非司酮濃度越高則產(chǎn)生的P-gp量越少，見圖3、圖4，結(jié)果說明誘導耐藥產(chǎn)生的同時加入米非司酮可減慢卵巢癌細胞耐藥性的產(chǎn)生。

圖3 應(yīng)用紫杉醇后A2780各組P-gp含量

圖4 應(yīng)用紫杉醇后skov3各組P-gp含量

3 討論

卵巢癌腫瘤細胞減滅術(shù)及術(shù)后化療是目前治療卵巢癌的主要方法，由于卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)不易徹底切除的特點，化療在卵巢癌治療中起了極為重要的作用［1］。但隨著化療療程的增加，大部分化療患者出現(xiàn)了耐藥性，導致化療失敗，5年生存率無明顯改善，這些年來，MDR基因及其表達物P糖蛋白介導的多重耐藥是腫瘤細胞耐藥研究的熱點，MDR基因的表達與多種癌癥細胞化療耐藥相關(guān)［2］。P糖蛋白介導的多重耐藥是各類腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的經(jīng)典途徑，是目前研究相對較為深入，同時機理較為清晰的途徑。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞的多重耐藥的產(chǎn)生與MDR1基因擴增，進而使的MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄增加、P-gP產(chǎn)生及增多有關(guān)［3-4］;同時，另一些耐藥腫瘤細胞雖無MDR1基因擴增，但卻有mRNA轉(zhuǎn)錄增加，最終使的P-gP表達增加［5］，抑制 MDR 的表達可以抑制耐藥性的產(chǎn)生［6］。同時，近年發(fā)現(xiàn)米非司酮等藥物對婦科惡性腫瘤的治療具有一定的潛力，作為逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物［7］，至今尚未成功用于臨床。因此，探討對卵巢癌常用藥物紫杉醇的耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥的機理就成了提高患者生存期的關(guān)鍵。米非司酮對耐藥的卵巢癌細胞有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，本實驗旨在研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導卵巢癌細胞A2780、skov3的耐藥性產(chǎn)生過程中所起的作用，是否有降低其耐藥性產(chǎn)生速度的可能。

實驗通過在紫杉醇誘導A2780、skov3產(chǎn)生耐藥過程同時使用不同濃度的米非司酮產(chǎn)生出各不同濃度的米非司酮與紫杉醇誘導后的A2780、skov3細胞亞株，觀察各細胞亞株P(guān)糖蛋白(P-gp)表達情況及各細胞亞株的P-gp的含量、檢測其生長曲線、IC50;以羅丹明123(Rh123)作為熒光探針觀察各細胞亞株胞內(nèi)羅丹明含量來研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導卵巢癌細胞株A2780、skov3的耐藥性的產(chǎn)生。結(jié)果顯示:①A2780、skov3細胞誘導后細胞較誘導前變小，細胞有呈團簇狀生長的趨勢。加用米非司酮的各組細胞也呈現(xiàn)出上述變化的特點，但加入米非司酮濃度大者細胞壞死出現(xiàn)的越明顯，其恢復對數(shù)生長期的時間越長。②兩組生長曲線檢測:使用紫杉醇沖擊法誘導體外卵巢癌細胞系(A2780、skov3)可以使細胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對不旺盛的亞群。加入米非司酮的濃度越大，篩選出的亞克隆生長越不活躍。③通過對半數(shù)致死濃度(IC50值)的測定，使用紫杉醇作為誘導劑后:首先各組細胞對于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780、skov3細胞對于紫杉醇的耐藥性有顯著性差異。其次，使用米非司酮的各組與不使用的陽性對照組對于紫杉醇的耐藥性也有顯著性差異。最后3組實驗組對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定的量效關(guān)系，使用高濃度米非司酮的實驗組耐藥性產(chǎn)生的較慢即能相對的保持對紫杉醇的敏感性。A2780、skov3兩組細胞表現(xiàn)出類似的實驗結(jié)果，說明化療同時使用非司酮能保持對卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。④應(yīng)用流式細胞儀檢測P-gp功能，羅丹明熒光強度說明在加入了不同濃度米非司酮后，在模擬臨床化療，誘導產(chǎn)生耐藥的過程中，米非司酮可以增加羅丹明在A2780、skov3兩組細胞內(nèi)的蓄積，并與其用量相關(guān)。這使得我們從功能上了解了米非司酮抑制耐藥性的可能機理應(yīng)該與減低細胞非特異性外排的機能高度相關(guān)。⑤免疫組化及Western Blotting結(jié)果顯示，使用紫杉醇誘導A2780組呈現(xiàn)出與紫杉醇誘導skov3組相似的結(jié)果，經(jīng)過紫杉醇的誘導后，加入不同劑量的米非司酮均有P-gp表達出現(xiàn)，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達量與誘導同時加入米非司酮的量呈負相關(guān)，即加入劑量越大的米非司酮則產(chǎn)生的P-gp越少，這從機理上驗證了由前面MTT實驗結(jié)果得出的、在誘導耐藥產(chǎn)生的同時加入米非司酮，減慢了卵巢癌細胞的耐藥性的產(chǎn)生。

米非司酮對人耐藥卵巢癌細胞的增殖有一定的抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強。米非司酮抑制耐藥性表現(xiàn)應(yīng)該與減低細胞非特異性外排的機能有關(guān)，其對卵巢癌的治療具有進一步的臨床研究價值。

［1］Lubin J，Markowska A，Knapp P.Factors affecting response of chemotherapy in women with ovarian cancer〔J〕.Eur Gynaecol Oncol，2012，33(6):644.

［2］謝紅旗，徐顯輝，柯明耀，等.多藥耐藥相關(guān)蛋白基因在肺癌組織中的表達及意義〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(2):152.

［3］Januchowski R，Wojtowicz K，Sujka-Kordowska P，et al.MDR gene expression analysis of six drug-resistant ovarian cancer cell lines〔J〕.Biomed Res Int，2013，2013:241763.

［4］Sedláková I，Laco J，To?ner J，et al.Proteins of resistance and drug resistance in ovarian carcinoma patients〔J〕.Klin Onkol，2012，25(6):457.

［5］Ding S，Chamberlain M，McLaren A，et al.Related Articles，Links Cross-talk between signalling pathways and the multidrug resistant protein MDR-1〔J〕.Cancer，2008，85(8):1175.

［6］Zhang H，Wang J，Cai K，et al.Downregulation of gene MDR1 by shRNA to reverse multidrug-resistance of ovarian cancer A2780 cells〔J〕.Cancer Res Ther，2012，8(2):226.

［7］Qiu J，F(xiàn)u YF，Cheng Q，et al.Reversing paclitaxel-resistance of skov3-TR30 cell line by curcumin〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2012，92(27):1926.