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        重樓皂苷對(duì)兔眼角膜B16惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性

        2013-02-27 02:30:42蘭海濤劉顯波
        實(shí)用癌癥雜志 2013年5期
        關(guān)鍵詞:眼角膜重樓黑色素瘤

        蘭海濤 曲 超 劉顯波 吳 琦

        在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,重樓(Rhizoma Paridis)常被組成方劑用于癌癥的治療?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)重樓對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,而皂苷(saponins)是其主要藥效成分[1-3]。目前臨床上多以順鉑等鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療來(lái)治療多種實(shí)體腫瘤[4-5]。本研究應(yīng)用B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞兔眼角膜層間注射構(gòu)建的動(dòng)物腫瘤模型,觀察重樓總皂苷對(duì)兔眼角膜B16惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用,進(jìn)一步了解重樓皂苷在體內(nèi)的抗腫瘤活性,為臨床新藥的篩選奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 藥物

        由四川大學(xué)華西藥學(xué)院生藥教研室完成重樓皂苷化學(xué)成分的分離鑒定工作,提取得到滇重樓皂苷。順鉑溶于生理鹽水濃度為10 mmol/L,此濃度相當(dāng)于臨床化療體內(nèi)藥物峰值濃度。

        1.2 B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞腫瘤動(dòng)物模型

        1.2.1 B16混懸液的配置 B16鼠黑色素瘤細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所,由我院分子遺傳實(shí)驗(yàn)室凍存?zhèn)溆?。?xì)胞復(fù)蘇后,常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液中,置于5%CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)。對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化,收集于無(wú)血清的培養(yǎng)液中,輕輕搖動(dòng),細(xì)胞懸液經(jīng)計(jì)數(shù)濃度為5×106/ml。錐蟲藍(lán)染色,檢測(cè)細(xì)胞活力在95%以上。

        1.2.2 兔角膜層間B16細(xì)胞的接種 大耳白兔兔匣固定,蓓諾喜眼液表面麻醉3~5次。左手持有齒顯微鑷,固定結(jié)膜;右手用胰島素注射針,刺入角膜層間,刺入點(diǎn)距離角膜中心2~3 mm,在角膜層間前行,推注20 μl B16 混懸液。

        1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

        日本大耳白兔18只,雌雄各半,體重在2.0~2.5 kg,來(lái)自四川省人民醫(yī)院動(dòng)物房。B16細(xì)胞兔眼角膜接種7 d后分為3組,分別應(yīng)用重樓皂苷(250 μg/ml,重樓皂苷組),順鉑(對(duì)照組)和生理鹽水(空白對(duì)照組),于第7、14、21、28天進(jìn)行角膜層間注射給藥,瘤區(qū)多點(diǎn)注射。

        1.4 裂隙燈觀察和色素記錄

        大耳白兔兔匣固定,表面麻醉后,應(yīng)用裂隙燈顯微數(shù)字圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行照相,觀察B16色素細(xì)胞生長(zhǎng)過程。應(yīng)用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)計(jì)算黑色素面積,代表腫瘤生長(zhǎng)情況。分別于接種當(dāng)天、第7、14、21、28天裂隙燈顯微鏡下觀察腫瘤生長(zhǎng)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注藥第7、14、21及28天時(shí)腫瘤的生長(zhǎng)情況見圖1~圖3:可見空白對(duì)照組黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì);重樓皂苷和順鉑均能抑制B16黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(F=39.12,P=0.000);重樓皂苷組與順鉑組間黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較無(wú)顯著性差異(P=0.966)。B16細(xì)胞兔眼角膜層間接種當(dāng)天、第7天及角膜層間注射生理鹽水、順鉑和重樓皂苷第28天時(shí)B16細(xì)胞實(shí)際生長(zhǎng)情況,見圖4。

        圖1 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長(zhǎng)情況(空白對(duì)照組)

        圖2 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長(zhǎng)情況(順鉑對(duì)照組)

        圖3 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長(zhǎng)情況(重樓皂苷組)

        圖4 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長(zhǎng)情況

        3 討論

        中藥重樓是延齡草科重樓屬的總稱,中國(guó)藥典2000版、2005版收載為滇重樓和七葉一枝花的干燥根莖,民間使用的重樓品種較多,側(cè)重不同。現(xiàn)代藥理表明其具有抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)及心血管方面等活性,重樓主要活性成分為甾體皂苷,由于苷元不同、糖配基種類及鏈接方式不同,所以其活性也表現(xiàn)出差異性[6]。多個(gè)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究表明重樓皂苷具有較好的抗腫瘤活性。顏璐璐等[7]以小鼠肺腺癌細(xì)胞株LA795為研究模型,研究滇重樓皂苷的抗肺癌活性,認(rèn)為重樓總皂苷成分在體外、體內(nèi)皆有強(qiáng)的抗肺癌作用。朱麗麗等[8]認(rèn)為重樓皂苷可通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗胃癌SGC-7910細(xì)胞株增殖的作用。畢葳等[9]應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜模型研究重樓皂苷抑制血管生長(zhǎng)的活性,研究表明重樓可能是1種有效的血管生成抑制劑。陳志紅等[10]研究表明重樓總皂苷對(duì)人肺癌細(xì)胞A549有較高敏感性,毒性小,制備工藝簡(jiǎn)單。順鉑是臨床上廣泛使用的一線廣譜化療藥物,對(duì)多種實(shí)體腫瘤有較好療效。

        B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞,可以產(chǎn)生黑色素,作為細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和增生的可視指標(biāo);尤其在角膜透明的背景下,通過裂隙燈照相,利用圖像分析軟件,可以將細(xì)胞數(shù)量半定量化,所以利用B16角膜接種模型的優(yōu)勢(shì)可以篩選、評(píng)估抗腫瘤藥物的療效。本研究結(jié)果顯示與生理鹽水空白對(duì)照比較,重樓皂苷和順鉑均能抑制兔眼角膜層間B16黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),差異有顯著性;重樓皂苷組與順鉑組間黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較無(wú)顯著性差異。研究顯示重樓皂苷在B16細(xì)胞兔眼角膜動(dòng)物模型上顯示具有較好的抗腫瘤活性。

        本研究應(yīng)用兔眼角膜B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物模型,顯示了重樓皂苷具有的抑瘤活性。重樓皂苷是重樓抗腫瘤作用的主要成分,相對(duì)重樓皂苷單體化合物而言,重樓總皂苷具有提取工藝相對(duì)簡(jiǎn)單和多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的藥效優(yōu)勢(shì);相對(duì)重樓醇提物等簡(jiǎn)單提取方法得到的中藥粗提物而言,重樓總皂苷具有提高藥物療效,降低副作用等優(yōu)勢(shì)。重樓皂苷有望成為新的安全有效的抗腫瘤藥,有較好的開發(fā)利用前景。

        [1]趙保勝,朱寅荻,馬 勇,等.中醫(yī)重樓研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(11):267.

        [2]王艷霞.重樓抗腫瘤活性成分的體外實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.包頭醫(yī)學(xué),2008,32(4):196.

        [3]王 羽,張彥軍,高文遠(yuǎn),等.滇重樓的抗腫瘤活性成分研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志,2007,32(14):1435.

        [4]陳 劍,張鼎儒,李鴻波,等.誘導(dǎo)化療加放療同步化療非小細(xì)胞肺癌的療效觀察〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2012,27(2):187.

        [5]金永東,梅 開,陳 萍,等.多西他賽聯(lián)合順鉑治療晚期頭頸部腫瘤的療效觀察〔J〕.腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2013,26(3):243.

        [6]張 嫚,李彥文,李志勇,等.重樓屬藥用植物的研究進(jìn)展〔J〕.環(huán)球中醫(yī)藥,2011,4(2):145.

        [7]顏璐璐,張艷軍,高文遠(yuǎn),等.滇重樓皂苷成分體內(nèi)外抗肺癌活性研究〔J〕.中草藥,2009,40(3):424.

        [8]朱麗麗,李惠芬.重樓皂苷對(duì)SGC-7910細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(6):1501.

        [9]畢 葳,沈 葹,王鵬龍,等.重樓中幾個(gè)甾體皂苷類成分對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響〔J〕.中成藥,2012,34(8):1536.

        [10]陳志紅,龔先玲,劉 義,等.重樓總皂苷對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用及對(duì)細(xì)胞周期的影響〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(15):2687.

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