曾會龍 羅慶豐 劉志禮 詹名花 張志宏 陳文昭 龍新華

近年來，研究表明FASN在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)過表達(dá)［1-3］，且FASN表達(dá)改變在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能扮演著重要角色［4-5］。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類長約20～25個核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡過程中起重要作用［6］。本研究構(gòu)建靶向抑制FASN基因表達(dá)的miRNA重組質(zhì)粒，檢測其對FASN在人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究FASN基因在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

U2-OS細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫;LipofectamineTM2000和質(zhì)粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體購自invitrogen公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計與合成miRNA寡聚單鏈DNA序列 根據(jù)NCBI查詢到人FASN蛋白的編碼基因FASN的cDNA序列(NM_004104.4)，設(shè)計合成4對miRNA和1對陰性對照寡聚單鏈DNA(表1)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與測序 將寡聚單鏈DNA退火成雙鏈，載體構(gòu)建試劑盒進(jìn)行重組克隆，將4對雙鏈的miRNA oligos分別克隆到miRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，構(gòu)建4個miRNA質(zhì)粒(簡稱X197-1、2、3、4)并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，搖菌抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測序。

1.2.3 人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染 U2-OS細(xì)胞用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以質(zhì)粒(μg):脂質(zhì)體(μl)為1∶3轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U2-0S，24 h后觀察熒光。熒光率是指在熒光顯微鏡下計算20個高倍視野的熒光細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.4 PCR檢測 FASN mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后用TRNzol(北京天根生化)提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。FASN上游引物5＇-ATTCCGGGCCAAGTTCTAC-3＇，下游引物 5＇-GCGCATGTACAGCTCG TG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長 294 bp;β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增產(chǎn)物長443 bp。相對抑制率(%)=(對照組-干擾組)/對照組×100%。

1.2.5 Western blot檢測 FASN蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取15 μg蛋白樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，一抗為兔抗人FASN多克隆抗體(1∶1000)和鼠抗人 β-actin單抗(1∶1000)，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5000)孵育。相對抑制率(%)=(對照組-干擾組)/對照組×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA真核表達(dá)載體的測序

測序結(jié)果表明，所獲得的重組干擾質(zhì)粒目的片段與預(yù)期的完全相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功并正確連接入pcDNA6·2-GW/EmGFP-miR載體(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞效率

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24 h后有較多細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光(圖2A、B、C、D)。4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞的熒光率，其中X197-1熒光率＞60%，X197-2熒光率＞50%，見圖2E。

2.3 重組質(zhì)粒對FASN mRNA和FASN蛋白表達(dá)的影響

構(gòu)建的4種質(zhì)粒均下調(diào)了U2-OS細(xì)胞內(nèi)FASN mRNA表達(dá)水平(圖3A)。4種質(zhì)粒的FASN mRNA相對抑制率顯著低于對照組(P＜0.05)，其中以質(zhì)粒X197-1、X197-4最為顯著，見圖3B。

構(gòu)建的4種質(zhì)粒均下調(diào)了U2-OS細(xì)胞內(nèi)FASN蛋白表達(dá)水平(圖3C)。4種質(zhì)粒FASN/β-actin灰度值比提示4種質(zhì)粒均能有效抑制FASN蛋白表達(dá)，其中以X197-1抑制作用最強(qiáng)，見圖3D。

圖1 shRNA測序圖

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞熒光圖(×200)

3 討論

研究表明除哺乳期的乳腺和周期性的子宮內(nèi)外，F(xiàn)ASN在正常組織中低水平表達(dá)，但是在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，我們前期研究也證實FASN在骨肉瘤中呈高表達(dá)［7］。Murata 等［4］和 Carvalho 等［8］發(fā)現(xiàn)FASN活性下降能減少結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移和黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。我們前期研究證實FASN在骨肉瘤組織中高表達(dá)，并發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組織中的水平［9］，并且FASN特異性抑制cerulenin能在體內(nèi)外誘導(dǎo)U2-OS細(xì)胞凋亡，而抑制其增殖［10］。上述均強(qiáng)烈提示FASN基因有望成為骨肉瘤治療的分子靶點，但是能否成為骨肉瘤轉(zhuǎn)移治療的靶點有待研究。

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U2-OS后對FASN表達(dá)的抑制

pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR是一個同時帶有殺稻瘟菌素抗性和GFP標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，一方面可以利用殺稻瘟菌素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，另一方面GFP表達(dá)出綠色熒光蛋白可以用以確定轉(zhuǎn)染效率，是RNAi技術(shù)中重要的研究工具。本研究應(yīng)用新一代BLOCK-iTTMPol II miR RNAi技術(shù)，以 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體，針對人FASN基因的cDNA序列構(gòu)建FASN干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒均能有效的抑制FASN表達(dá)，說明構(gòu)建的質(zhì)粒完全達(dá)到有效干擾目的基因表達(dá)的要求，為進(jìn)一步研究FASN對骨肉瘤細(xì)胞遷徙、侵襲的影響及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了靶向FASN基因的miRNA干擾質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究FASN對骨肉瘤細(xì)胞遷徙、侵襲的影響及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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