延光海，金光玉，樸紅梅，鄭明昱，李良昌，李光昭

(延邊大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研部、2.附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、3.中醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，吉林 延吉 133002)

氣道重塑(airway remodeling)是支氣管哮喘的重要特征之一，表現(xiàn)為氣道平滑肌增厚、杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化、肌成纖維細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等［1］。mTOR屬于磷酸肌醇激酶3相關(guān)激酶(PIKKs)家族的一員，是PI3K/Akt的下游底物，可通過(guò)改變翻譯調(diào)節(jié)因子p70s6k和4E-BPI的磷酸化狀態(tài)啟動(dòng)翻譯過(guò)程。近年來(lái)研究表明mTOR與人體炎癥、損傷、增生、組織修復(fù)、纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)［2－3］。在本研究中，我們給予 mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)觀察肺泡灌洗液和肺組織中各種炎性因子的變化，探討雷帕霉素有無(wú)選擇性抑制氣道炎癥，而進(jìn)一步闡明其阻止氣道重塑的發(fā)生機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物♂BALB/c小鼠30只，體質(zhì)量(18±5)g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)，SCXK(吉)2011-0007。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即正常對(duì)照組、哮喘模型組、雷帕霉素治療組，每組10只。

1.2 藥品與試劑卵蛋白(OVA，Sigma);氫氧化鋁粉(分析純，Sigma);細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 檢測(cè)試劑盒(北京晶美生物工程有限公司)。mTOR抗體為美國(guó)Santa Cruz產(chǎn)品。

1.3 儀器設(shè)備霧化器(大連醫(yī)療器械廠U219，歐姆龍);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(RT-2100C，美國(guó));電泳儀及電泳槽(E-C Apparatus Corporation，美國(guó));Western blot轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的復(fù)制模型制備參照延光海等［4］報(bào)道的方法:哮喘組和雷帕霉素治療組均用0.5 ml致敏混懸液〔含OVA 8 μg和AL(OH)3干粉4 mg〕腹腔內(nèi)共注射2次，注射間隔時(shí)間為5 d(d 1及d 6)，對(duì)照組用生理鹽水0.5 ml代替。自d 18開(kāi)始激發(fā)，哮喘組和雷帕霉素治療組予以1%OVA生理鹽水5 ml霧化吸入，每日1次，每次30 min，分別持續(xù)7 d。對(duì)照組用生理鹽水5 ml代替OVA處理。激發(fā)之前正常對(duì)照組和哮喘模型組氣道內(nèi)給予生理鹽水0.5 ml;雷帕霉素治療組分別在激發(fā)1 d前開(kāi)始?xì)獾纼?nèi)給予稀釋于生理鹽水中的4 mg·kg－1的雷帕霉素，每天1次，給予4 d。末次激發(fā)24 h后處死小鼠，剪開(kāi)頸部皮膚，并于氣管正中處剪一小口，插入氣管套管。以磷酸鹽緩沖液1 ml行支氣管肺泡灌洗，來(lái)回沖洗3次，收集BALF?；靹駼ALF，3 000 r·min－1離心10 min，取上清液，－80℃低溫保存，待測(cè)細(xì)胞因子。

2.2 BALF 中細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 含量的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果以ng·L－1表示。

2.3 組織學(xué)檢查肺組織經(jīng)甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，并做蘇木精-伊紅(HE)染色和PAS染色。每只小鼠隨機(jī)選3張肺組織切片，每張切片以單盲法隨機(jī)選取橫斷面較圓、直徑100 μm的細(xì)支氣管5支觀察。

2.4 免疫組化流程及半定量測(cè)定使用鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶連結(jié)法(streptavidin perosidase，SP法)進(jìn)行檢測(cè)。組織切片脫蠟后置于0.01 mol·L－1檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波15 min抗原修復(fù)，冷卻后用3 g·L－1H2O2處理30 min(37℃)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;1∶10正常馬血清封閉30 min(37℃);棄上清液后直接加抗鼠mTOR(1∶400稀釋)一抗，4℃過(guò)夜;依次加羊抗鼠抗體與辣根過(guò)氧化酶室溫下各孵育30 min(37℃);滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫顯色。結(jié)果判定為陽(yáng)性細(xì)胞呈棕色，陽(yáng)性信號(hào)為胞質(zhì)/胞核內(nèi)棕黃色顆粒。采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定mTOR含量，以校正后的平均光密度表示。平均光密度為累積光密度(IOD SUM)除以選定區(qū)域的面積(area SUM)。

2.5 肺組織mTOR蛋白表達(dá)檢測(cè)取200 mg肺組織置入分別加入蛋白裂解液0.5 ml勻漿，4℃12 000×g離心2 min，取上清液測(cè)蛋白濃度。取25 g蛋白煮沸5 min后，經(jīng)15%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉－PBST溶液室溫下封閉2 h，加入mTOR抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋度為1∶200，37℃，1 h。洗膜后在暗室中加 ECL發(fā)光試劑，X線膠片曝光1～2 min后顯影、定影。雜交信號(hào)在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用β-actin作為蛋白上樣量對(duì)照，其余組與其相比得到相對(duì)量，取均值。

2.6 氣道高反應(yīng)的檢測(cè)所有動(dòng)物于OVA吸入后24 h行支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)。給予4%戊巴比妥，按60 mg·kg－1BW劑量行腹腔注射麻醉，待其疼痛反射消失后，將小鼠仰臥位置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能檢測(cè)分析系統(tǒng)(AniRes2005，北京貝蘭博科技有限公司)的體積描記箱內(nèi)，切開(kāi)皮膚分離皮下組織，暴露氣管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，插入氣管插管。游離頸外靜脈并穿刺，固定針柄，封閉體描箱。按濃度倍增法依次靜脈注射甲乙酰膽堿(methacholine 2.5、5.0、10、25、50 g·L－1)，頸外靜脈每次注射0.2 ml。待氣道阻力降至正常后開(kāi)始下一劑量，記錄波形及數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)值用±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。

3 結(jié)果

3.1 BALF 中細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-3 的變化從Tab 1中可見(jiàn)，哮喘模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-3水平升高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.05);雷帕霉素干預(yù)組大鼠BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-3水平降低，與哮喘模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Changes of IL-4，IL-5，IL-3 level in BALF(±s，n=10)

Tab 1 Changes of IL-4，IL-5，IL-3 level in BALF(±s，n=10)

##P＜0.01 vs saline group;*P＜0.05 vs OVA group

Group IL-4/ng·L－1 IL-5/ng·L－1 IL-3/ng·L －1Saline 14.9 ±1.3 19.8 ±4.3 21.2 ±11.5 OVA 56.5 ±4.2## 62.7 ±8.6## 86.4 ±14.7##Rapamycin 47.9 ±3.4* 50.2 ±6.3* 60.1 ±11.3*

3.2 肺組織的病理學(xué)改變光鏡下觀察HE染色、PAS染色結(jié)果顯示，F(xiàn)ig 1的A、D為正常對(duì)照組氣道無(wú)明顯改變。Fig 1的B、E為哮喘模型組氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，杯狀細(xì)胞化生，炎癥細(xì)胞(尤其嗜酸性粒細(xì)胞)明顯增多，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01):Fig 1的C、F雷帕霉素治療組上述改變較哮喘組明顯減輕，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

Fig 1 Effect of Rapamycin on infiltration of inflammatory cells(×200)

3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織mTOR蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組(Fig 2A)小鼠支氣管mTOR蛋白呈淡棕黃色弱免疫反應(yīng)表達(dá)。哮喘模型組(Fig 2B)小鼠氣道平滑肌、嗜酸性粒細(xì)胞，杯狀細(xì)胞mTOR蛋白呈強(qiáng)棕黃色強(qiáng)免疫反應(yīng)表達(dá)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。雷帕霉素治療組Fig 2C與哮喘模型組相比較，氣道平滑肌、嗜酸性粒細(xì)胞，杯狀細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)明顯減弱，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

3.4 肺組織mTOR蛋白表達(dá)水平哮喘模型組肺組織的mTOR蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);哮喘組肺組織的mTOR蛋白表達(dá)高于雷帕霉素治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)Fig 3。

3.5 雷帕霉素對(duì)氣道高反應(yīng)的影響隨著甲乙酰膽堿濃度的成倍遞增，模型組與對(duì)照組的吸氣阻力均有增加，當(dāng)濃度到達(dá)10 g·L－1以上時(shí)，模型組與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，見(jiàn)Fig 4。

4 討論

支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞和多種炎癥介質(zhì)參與的慢性氣道炎癥。Th2細(xì)胞亞群主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-3等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、聚集、活化、脫顆粒，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［5］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預(yù)組與哮喘模型組比較BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及IL-4、IL-5、IL-3水平降低。

Fig 2 Immunohistochemistry staining of mTOR protein in lung(×200)

Fig 3 Effect of mTOR protein expression in lung tissues and of OVA-sensitized and-challenged mice

Fig 4 Effect of Rapamycin on airway hyperresponsivness(AHR)to methacholine

雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，能抑制許多細(xì)胞的增生，包括T細(xì)胞分化、氣道平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等［6］。雷帕霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)是mTOR，進(jìn)入細(xì)胞與FKBP12形成RPM/FKBP12復(fù)合物，復(fù)合物結(jié)合mTOR并以滅其功能，從而阻斷了mTOR介導(dǎo)的信號(hào)通路。近期研究表明，T細(xì)胞缺乏mTOR時(shí)不能轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)h1、Th2或Th17效應(yīng)細(xì)胞［7］。這些研究指出mTOR在T細(xì)胞分化過(guò)程中扮演著極其重要的角色。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在哮喘模型組嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)度表達(dá)mTOR蛋白，說(shuō)明嗜酸性粒細(xì)胞的活化、聚集與mTOR蛋白的激活密切相關(guān)。IL-4是誘導(dǎo)Th2淋巴細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-4誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生IgE，最終形成以IgE依賴為特征的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性氣道炎癥［8］;IL-5通過(guò)調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、聚集、脫顆粒等參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展［9］;研究表明IL-3產(chǎn)于Th2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，是支氣管哮喘的中樞調(diào)點(diǎn)，氣道內(nèi)IL-3水平增加、其表達(dá)與氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞增加數(shù)量產(chǎn)生有關(guān)［10］。以上研究表明mTOR的激活可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞活化與聚集，并進(jìn)一步誘導(dǎo)釋放和激活 IL-4、IL-5、IL-3等炎癥細(xì)胞因子的釋放。

研究證明mTOR/p70S6K信號(hào)通路在氣道平滑肌的生長(zhǎng)和增殖中起著關(guān)鍵作用，可能是防止哮喘中平滑肌重塑的選擇性靶點(diǎn)［11］。本實(shí)驗(yàn)中我們研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型組增生的氣道平滑肌過(guò)度表達(dá)mTOR蛋白，說(shuō)明mTOR激活可誘導(dǎo)氣道平滑肌增生、肥大。氣道高反應(yīng)性(AHR)是哮喘的特征性表現(xiàn)之一，它的出現(xiàn)表示氣道平滑肌收縮閾值降低。研究證實(shí)AHR和氣道平滑肌增生、肥大密切相關(guān)［12］，而氣道炎癥可誘導(dǎo)氣道平滑肌增生與肥大［13］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路降低Th2類(lèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，近而減輕了氣道炎癥，同時(shí)減輕了由于炎癥本身引起的氣道阻力增加。對(duì)于雷帕霉素如何調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們推測(cè)雷帕霉素對(duì)氣道平滑肌增殖和氣道杯狀細(xì)胞過(guò)度活化的抑制作用是通過(guò)阻斷mTOR信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)的。

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