劉麗波，孟繁杰，薛一雪，劉云會

(1.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110004)

腦膠質(zhì)瘤是惡性程度很高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%。腦膠質(zhì)瘤患者雖經(jīng)手術(shù)、放療及化療等多種治療手段的干預(yù)，但死亡率仍高達98%以上，因此提高療效，延長患者的生存期成為亟待解決的一大難題［1］。內(nèi)皮-單核細胞激活多肽Ⅱ(endothelial monocyte activating polypeptideⅡ，EMAP-Ⅱ)是從甲基膽蒽A誘導(dǎo)形成的纖維肉瘤細胞的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，具有促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的特性［2］。研究顯示，EMAP-Ⅱ能夠抑制多種原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤的生長、增殖和侵襲，因而被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療的研究［3］。自噬(又稱為Ⅱ型程序性死亡)是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，是利用溶酶體清除受損細胞器及異常蛋白質(zhì)的過程，與細胞穩(wěn)態(tài)的維持和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在腫瘤的發(fā)生過程中，自噬通過影響細胞周期、調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡以及調(diào)控腫瘤血管生成等方面參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［4］。但EMAP-Ⅱ是否通過誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖，尚不清楚。本研究擬以人U118膠質(zhì)瘤細胞為研究對象，觀察EMAP-Ⅱ?qū)ψ允蓸酥镜鞍譒C3、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達水平的影響，探討 EMAP-Ⅱ抑制人U118細胞活力及誘導(dǎo)自噬的作用效果及可能機制，為EMAP-Ⅱ的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器EMAP-Ⅱ (PeproTech公司);MTT、3-MA(Sigma公司);DMEM細胞培養(yǎng)液(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);兔抗LC3多克隆抗體、小鼠抗p62/SQSTM1單克隆抗體和兔抗Beclin1多克隆抗體(Abcam公司);小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、TRITC標記的二抗和ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(Santa Cruz公司)。主要儀器:多功能酶標儀(Molecular Devices，美國)，正置顯微鏡(Olympus，日本)，電泳裝置(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)人U118神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株由中國醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室保存。用高糖DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)U118細胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞活力測定細胞活力采用MTT方法檢測。制備U118細胞懸液，以每孔100 μl含1×104細胞數(shù)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后對照組(DMEM培養(yǎng)液)和不同濃度的 EMAP-Ⅱ (0.005、0.05和0.5 nmol·L－1)組分別作用0.5、1、2、3和6h，而后終止反應(yīng)，棄去培養(yǎng)液，加入0.5 g·L－1的 MTT溶液孵育4 h，棄去液體，加入100 μl DMSO振蕩溶解10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標儀測定490 nm波長處各孔光吸收值。實驗重復(fù)8次。

1.4 流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位取對數(shù)生長期的U118細胞，分組給藥后，收集5×105個細胞，用PBS洗滌2次，取500 μl JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 20 min，收集細胞，用1×孵育緩沖液洗滌2次，用500 μl的1×孵育緩沖液重新懸浮細胞。用流式細胞儀檢測，綠色熒光通過通道FL1檢測，紅色熒光通過通道FL2檢測。JC-1的聚集依賴于線粒體的膜電位，在線粒體膜電位較高時，JC-1以多聚體的形式聚集在線粒體內(nèi)發(fā)紅色熒光;當線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集到線粒體內(nèi)，以單體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。

1.5 免疫熒光法檢測LC3的表達和分布4%多聚甲醛固定EMAP-Ⅱ作用不同時間的生長在蓋玻片上的U118細胞，PBS漂洗后用10%BSA封閉30 min，兔抗LC3一抗反應(yīng)過夜(陰性對照用0.01 mol·L－1的PBS代替一抗)，PBS清洗后用TRITC標記的二抗避光條件下反應(yīng)30 min，甘油封片，在熒光顯微鏡下，用激發(fā)波長為565 nm的濾光片進行觀察，采集圖像。

1.6 Western blot實驗收集EMAP-Ⅱ作用不同時間的人U118膠質(zhì)瘤細胞，加入RIPA裂解液(10 g ·L－1aprotinin，10 g·L－1PMSF 和50 mmol·L－1sodium orthovanadate)。采用考馬斯亮藍G250結(jié)合法測定細胞提取物的蛋白濃度，以每加樣孔10～20 μg蛋白總量經(jīng)SDS-PAGE電泳進行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于4℃用5%脫脂奶粉封閉過夜。分別加入LC3、p62/SQSTM1、Beclin1和 GAPDH 的一抗室溫2 h，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫2 h后，向膜上滴加ECL工作液，進行壓片曝光，顯影定影，用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描獲取圖像，通過Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，測得光密度值(integrated density value，IDV)。以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH的吸光度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EMAP-Ⅱ?qū)118細胞活力的影響如Fig 1A 所示，不同濃度(0.005、0.05 和0.5 nmol·L－1)的 EMAP-Ⅱ作用于 U118 細胞0.5、1、2、3 和6 h 后，U118細胞的活力受到明顯抑制，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時抑制效果最明顯;EMAP-Ⅱ抑制U118細胞活力的效果呈劑量依賴性，其中0.05和0.5 nmol·L－1EMAP-Ⅱ組之間沒有差異，證明0.05 nmol·L－1是EMAP-Ⅱ作用的最適劑量，因此我們選用0.05 nmol·L－1EMAP-Ⅱ進行后續(xù)實驗。

為檢測EMAP-Ⅱ是否通過誘導(dǎo)U118膠質(zhì)瘤細胞自噬抑制其活力，應(yīng)用5 mmol·L－1的3-MA預(yù)處理1 h 后給予0.05 nmol·L－1的 EMAP-Ⅱ，作用0.5 h后檢測U118細胞活力，結(jié)果顯示3-MA能夠有效阻斷EMAP-Ⅱ的作用，使細胞活力恢復(fù)(Fig 1B)。

2.2 EMAP-Ⅱ?qū)118細胞MMP的影響線粒體探針JC-1用于檢測細胞MMP，反映線粒體的功能。0.05 nmol·L－1的EMAP-Ⅱ作用后能夠明顯降低U118細胞的MMP，抑制線粒體功能，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時效果最明顯;3-MA能有效阻斷EMAP-Ⅱ的作用，使U118膠質(zhì)瘤細胞的MMP升高，線粒體功能恢復(fù)(Fig 2)。

Fig 1 A:Cells viability of human U118 glioma cells after treatment with 0.005，0.05 and 0.5 nmol·L－1EMAP-Ⅱ for 0.5，1，2，3 and 6 h(±s，n=8).*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0 h group values.B:Effects of 3-MA on cells viability of human U118 glioma cells after treatment with 0.05 nmol·L－1EMAP-Ⅱfor 0.5 h(±s，n=8).＊＊P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0 h group values;##P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0.5 h group values

Fig 2 Effects of EMAP-Ⅱand 3-MA on MMP of human U118 glioma cells(±s，n=5)

2.3 EMAP-Ⅱ?qū)C3分布和表達的影響免疫熒光染色顯示，EMAP-Ⅱ0 h組的U118細胞中，在細胞質(zhì)中可見到微弱的LC3熒光表達(Fig3A)。EMAP-Ⅱ作用后，LC3的表達明顯上調(diào)(Fig 3B)，呈點狀分布在細胞質(zhì)中。Western blot實驗結(jié)果也證實，EMAP-Ⅱ作用能夠明顯增加 LC3-Ⅱ的表達，在0.5 h時達峰值(Fig 4)。

Fig 3 Expression and distribution of LC3 analyzed by immunofluorescence assay after treatment with EMAP-Ⅱin human U118 glioma cells for 0.5 h

2.4 EMAP-Ⅱ作用后p62/SQSTM1和Beclin1在U118細胞中的表達EMAP-Ⅱ作用于U118細胞0.5、1、2、3 和 6 h 后，Western blot結(jié)果顯示，與EMAP-Ⅱ0 h組相比，EMAP-Ⅱ作用后自噬降解底物p62/SQSTM1的蛋白表達水平明顯下降，而自噬相關(guān)蛋白Beclin1的蛋白表達水平則明顯增加，二者均在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時變化最明顯(Fig 5)。

3 討論

目前對于腦膠質(zhì)瘤的治療，特別對于惡性或高級別膠質(zhì)瘤的治療，即使采取綜合治療仍然很難達到長期控制腫瘤?；熓悄z質(zhì)瘤綜合治療的重要環(huán)節(jié)，可提高患者生活質(zhì)量，延長平均中位生存期和無效進展期。近年研究發(fā)現(xiàn)，化療可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生自噬，并參與了自噬的分子調(diào)控［5］。目前，調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)已經(jīng)成為包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種癌癥治療的新靶點，對自噬調(diào)節(jié)機制的深入研究可能為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的有效途徑。

本研究中，我們應(yīng)用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，EMAP-Ⅱ能夠明顯降低人U118膠質(zhì)瘤細胞的活力，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時效果最明顯，隨著作用時間延長細胞活力逐漸恢復(fù)。為探討EMAP-Ⅱ作用能快速降低人U118細胞活力的原因，我們檢測了EMAP-Ⅱ?qū)θ薝118膠質(zhì)瘤細胞的MMP的影響，結(jié)果顯示EMAP-Ⅱ作用0.5 h即能有效降低U118細胞的MMP，抑制線粒體功能，隨著作用時間的延長MMP逐漸恢復(fù);上述結(jié)果顯示EMAP-Ⅱ能通過抑制線粒體功能影響人U118膠質(zhì)瘤細胞的活力，隨著EMAP-Ⅱ作用時間的延長，線粒體功能的恢復(fù)，導(dǎo)致細胞活力得以恢復(fù)。

EMAP-Ⅱ是否通過自噬途徑抑制U118膠質(zhì)瘤細胞活力，尚不清楚。LC3是檢測自噬的標志蛋白，細胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白:LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，分布于胞質(zhì)中;當自體吞噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并且LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來做為自噬體的標記，而且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量［6］。我們的研究結(jié)果顯示，EMAP-Ⅱ作用后人U118膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的點狀聚集明顯增多，并且 LC3-Ⅱ的蛋白表達水平明顯上調(diào)，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時上調(diào)最明顯。同時，Western blot結(jié)果顯示，EMAP-Ⅱ能夠降低U118細胞 p62/SQSTM1的蛋白表達，其變化趨勢與LC3-Ⅱ的趨勢相一致。p62/SQSTM1被認為是泛素化蛋白聚集體和自噬復(fù)合物之間的接頭蛋白，可與LC3結(jié)合定位于自噬體，作為自噬的一個選擇性降解底物，最終能被自噬溶酶體系統(tǒng)降解［7］。因此，p62/SQSTM1的表達也可以作為檢測自噬的一個指標。上述結(jié)果證明，EMAP-Ⅱ可通過誘導(dǎo)人U118膠質(zhì)瘤細胞的自噬，進而抑制細胞活力，但具體機制需要深入研究。

Beclin1是第一個確定的哺乳動物自噬蛋白，能夠與Vps34 PI3K(Ⅲ型)、紫外線照射耐藥相關(guān)基因等形成蛋白復(fù)合物，參與自噬體雙膜結(jié)構(gòu)的形成［4］。研究證明［8］Beclin1等位基因在人類乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌缺失，并且Beclin1的缺失能夠?qū)е滦∈竽[瘤的發(fā)生，而Beclin1表達的恢復(fù)則能誘導(dǎo)自噬，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。有報道認為［9］Beclin1也參與了腦膠質(zhì)瘤的自噬反應(yīng)。在本研究中，EMAP-Ⅱ作用后能夠明顯促進人U118膠質(zhì)瘤細胞中Beclin1的蛋白表達水平，提示Beclin1是EMAP-Ⅱ誘導(dǎo)U118細胞自噬，進而抑制其活力的調(diào)節(jié)機制之一。

自噬在癌癥和治療應(yīng)答中的作用很復(fù)雜，自噬既可以作為腫瘤抑制者，也可以作為癌細胞生存保護者［10］。在膠質(zhì)瘤的治療中，EMAP-Ⅱ?qū)θ?U118膠質(zhì)瘤細胞究竟起到怎樣的作用呢?我們應(yīng)用3-MA預(yù)處理后給予EMAP-Ⅱ，檢測U118膠質(zhì)瘤細胞的活力和 MMP，結(jié)果顯示3-MA能夠有效阻斷EMAP-Ⅱ抑制細胞活力和降低細胞MMP的能力，提示EMAP-Ⅱ可通過誘導(dǎo)細胞自噬，導(dǎo)致線粒體功能嚴重受損，抑制細胞活力。研究顯示自噬過程經(jīng)歷的時間相對較短［11］，隨著EMAP-Ⅱ作用時間的延長，自噬減少，能夠使U118膠質(zhì)瘤細胞的線粒體功能恢復(fù)，進而引起細胞活力恢復(fù)。

綜上所述，EMAP-Ⅱ能夠有效抑制人U118膠質(zhì)瘤細胞的活力，降低細胞MMP，其作用機制可能與EMAP-Ⅱ上調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達，進而降低p62/SQSTM1、增加LC3-Ⅱ的表達，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞自噬有關(guān)。

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