黃展勤，李金玉，姜紅巖，劉幸平，鄭燕珊，石剛剛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041)

心肌肥厚是高血壓、心肌梗死、瓣膜病、先天性心臟病等諸多心血管疾病的常見病變。其病理變化包括心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖以及心肌細(xì)胞外基質(zhì)增加等多方面的改變，即心肌重構(gòu)。心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭、增加猝死發(fā)生率的主要原因。心肌肥厚的產(chǎn)生除與血流動(dòng)力學(xué)有關(guān)外，還與各種神經(jīng)體液因子有關(guān)，尤其是兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ(AngII)及內(nèi)皮素等。AngII具有生長因子樣作用，它是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大的重要因素。AngII導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大是通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路得以實(shí)現(xiàn)的，MAPK通路是一條重要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與AngII誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)［1］。ERK1/2是MAPK家族中的成員之一，與心肌細(xì)胞肥大關(guān)系最為密切［2］。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是一核轉(zhuǎn)錄因子，可被多種細(xì)胞外刺激信號活化后發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。其中絲裂原與其受體結(jié)合后活化Ras，通過Ras-Raf-ERK1/2途徑活化 CREB［3］。有研究表明，CREB磷酸化異常在心肌肥厚基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用［4－5］。

碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)是本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成的專利化合物(國家發(fā)明專利號:ZL96119098.1)，前期研究已經(jīng)證明它具有良好的心血管活性，其機(jī)制可能與其阻斷心肌細(xì)胞膜鈣通道，防止鈣超載有關(guān)，對心肌缺血具有保護(hù)作用［6］。F2還可以通過影響MEK/ERK/Egr-1信號途徑對血管平滑肌細(xì)胞的增殖也具有抑制作用［7］。本研究在體外建立AngII誘導(dǎo)心肌肥大的細(xì)胞模型，觀察F2對心肌肥大的抑制作用，并進(jìn)一步觀察AngII引起核轉(zhuǎn)錄因子ERK1/2和CREB蛋白表達(dá)變化及F2對其的影響，以探討F2抑制心肌肥大可能的作用機(jī)制，從而拓展F2的心血管活性研究，為其進(jìn)一步研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器F2(本實(shí)驗(yàn)室合成，結(jié)構(gòu)由中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)所鑒定，實(shí)驗(yàn)前用0.01%DMSO溶解配成);胎牛血清(FBS)、高糖型DMEM培養(yǎng)基干粉(Gibco公司，美國)，BCA蛋白測試盒(Pierce Biotech公司，美國)，AngII(Sigma公司，美國)，兔源Actin多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔源 p-ERK1/2單克隆抗體、兔源ERK1/2單克隆抗體、兔源p-CREB單克隆抗體、兔源CREB單克隆抗體(Cell Signal公司，美國)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG抗體(Santa Cruz公司，美國)、預(yù)染蛋白梯度Marker(Fermentas公司，美國)、ELC化學(xué)發(fā)光顯色試劑(Pierce Biotech公司，美國)、Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞肥大模型的建立及給藥大鼠心肌細(xì)胞株(H9C2)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，且內(nèi)含1 ×105U·L－1青霉素、鏈霉素，置于 5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將正常培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化下來后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107·L－1，接種于6孔板中，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，換用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長進(jìn)入同步休止期，然后隨機(jī)分組干預(yù)，① Control組;② AngII組:培養(yǎng)液中含 10－7mol·L－1AngII;③ DMSO 組:培養(yǎng)液中含10－7mol·L－1AngII+10－5mol·L－1DMSO;④、⑤、⑥組分別為 F210－8mol·L－1組、F210－7mol·L－1組和 F210－6mol·L－1組:培養(yǎng)液中分別含有 10－7mol·L－1AngII+10－8、10－7和 10－6mol·L－1F2。以上各組培養(yǎng)液均含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。8～12 h更換1次培養(yǎng)液和藥物，相差顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 心肌細(xì)胞表面積的測定藥物處理好的心肌細(xì)胞用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液漂洗1次，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，用相差顯微鏡(100×)拍照，用Image Pro Plus 6.1軟件測量細(xì)胞表面積，每個(gè)視野選5～8個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)6次實(shí)驗(yàn)。

1.4 心肌細(xì)胞蛋白含量的測定藥物作用后，用0.125%胰酶消化細(xì)胞使之脫落，用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，500 r·min－1，離心 5 min，PBS 洗兩次，4℃，500 r·min－1，離心 5 min ，再用4℃的PBS將細(xì)胞重懸;用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞濃度，選取適當(dāng)體積的細(xì)胞懸液，獲得106個(gè)細(xì)胞，500 r·min－1，離心 5 min，棄 PBS，加適量的 Western 及IP細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，期間用移液器輕輕吹打數(shù)次。4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，收集蛋白。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照BCA法測定蛋白濃度。

1.5 Western blot檢測ERK1/2、CREB 蛋白表達(dá)按文獻(xiàn)方法［8］提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測。每孔加入50 μg蛋白樣品，以10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE凝膠電泳分離(濃縮膠80 V，分離膠100 V)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至NC膜上(100 V，70 min)，封閉，孵育一抗和二抗，ECL顯色，圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白條帶的光密度值。結(jié)果以β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以±s表示，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 F2抑制AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積的增大與Control組相比，AngII組心肌細(xì)胞表面積增大至2.75倍，DMSO組與AngII組心肌細(xì)胞表面積變化差異無顯著性(P ＞0.05)。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)組心肌細(xì)胞表面積分別增加至2.29倍，1.99倍和1.31 倍。與 AngII組相比，F(xiàn)210－8、10－7、10－6mol·L－1組心肌細(xì)胞表面積分別減少了17%、28%和52%。F2劑量依賴的抑制AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積的增大，各濃度組之間差異有顯著性(P＜0.01)，見 Fig 1、Tab 1。

Tab 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells( ± s，n=6)

Tab 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells( ± s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs Control;##P ＜0.01 vs AngII;△△P ＜0.01 vs F210－8mol·L－1;▲▲P ＜0.01 vs F210－7mol·L－1

Group Relative cell area of H9C2 cell Control 1 Ang Ⅱ 2.75 ±0.38＊＊DMSO 2.70 ±0.42＊＊Ang Ⅱ +F210 －8mol·L－1 2.29 ±0.36##Ang Ⅱ +F210 －7mol·L－1 1.99 ±0.32##△△Ang Ⅱ +F210 －6mol·L－1 1.31 ±0.27##△△▲▲

2.2 F2對心肌細(xì)胞總蛋白含量的影響與Control組相比，AngII組心肌細(xì)胞蛋白含量增加，DMSO組與AngII組心肌細(xì)胞蛋白含量變化差異無顯著性(P＞0.05)。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)劑量依賴的抑制AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白含量的增加，各濃度組之間差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 2。

Fig 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells(n=6)

Fig 2 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell total protein increasement in H9C2 cells(n=6)

2.3 F2對AngII激活ERK1/2的影響結(jié)果顯示，與Control組相比，AngII組和 DMSO+AngII組 p-ERK1/2蛋白表達(dá)均有增加(P＜0.01)，且兩組之間差異無顯著性(P＞0.05)。在AngII處理細(xì)胞1 min時(shí)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)開始增加，5～10 min到達(dá)表達(dá)高峰，30 min下降到最高峰的50%，活化時(shí)間可持續(xù)60 min。與AngII組相比，F(xiàn)2劑量依賴的降低AngII刺激心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加，各劑量組p-ERK1/2蛋白差異有顯著性(P＜0.01)，各組間ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見 Fig 3。

Fig 3 Effects of F2on p-ERK1/2 and ERK1/2 protein in H9C2 cells after AngII treatment(n=6)

2.4 F2對AngII激活CREB蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，AngII組和DMSO組p-CREB蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)，AngII組和DMSO+AngII組之間差異無顯著性(P＞0.05)。與AngII組相比，F(xiàn)2劑量依賴抑制CREB的活化，各劑量組p-CREB蛋白差異有顯著性(P＜0.01)。各組間CREB蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Fig 4。

3 討論

Fig 4 Effects of F2on p-CREB and CREB protein in H9C2 cells after AngII treatment(n=6)

H9C2細(xì)胞來源于胚胎期心臟，可以分裂，獲得細(xì)胞容易，并且對外界刺激因子作用的反應(yīng)較成熟期動(dòng)物心肌細(xì)胞敏感，可模擬心肌細(xì)胞的功能，進(jìn)行藥理學(xué)、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路等的實(shí)驗(yàn)研究。有研究表明［9］，新生大鼠心肌細(xì)胞與大鼠心肌H9C2細(xì)胞在AngII刺激下，二者形態(tài)學(xué)和肥大基因表達(dá)上有一定的相似性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用H9C2細(xì)胞建立心肌細(xì)胞肥大模型。AngII是腎素－血管緊張素系統(tǒng)中最為重要的活性成分，是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大的重要體液因素［10］。整體和器官水平以及在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上的研究相繼證實(shí)，AngII具有直接促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)。

心肌細(xì)胞肥大發(fā)生的生化基礎(chǔ)是心肌蛋白合成增加，進(jìn)而使心肌細(xì)胞體積增大。本實(shí)驗(yàn)在摸索AngII誘導(dǎo)心肌肥大模型時(shí)，選取了 10－6、10－7和10－8mol·L－13 種濃度，作用 48 h。AngII(10－6mol·L－1)在作用24 h時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，基本不能維持到 48 h，AngII(10－8mol·L－1)作用 48 h，細(xì)胞肥大不太明顯，10－7mol·L－1AngII可致細(xì)胞肥大較明顯，細(xì)胞生長狀態(tài)適中，結(jié)果重復(fù)性好，符合制備模型的標(biāo)準(zhǔn)，故選取10－7mol·L－1作為AngII的刺激濃度。結(jié)果顯示，用10－7mol·L－1AngII可以誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞肥大，表現(xiàn)為細(xì)胞表面積增大、細(xì)胞蛋白含量增加。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)能劑量依賴的降低 AngII誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞細(xì)胞表面積增大和細(xì)胞蛋白含量增多。以上結(jié)果表明，F(xiàn)2能抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，可能對心肌肥厚有一定的防治作用。

AngII導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大是通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路得以實(shí)現(xiàn)的，在各種參與AngII引起心肌細(xì)胞肥大的信號物質(zhì)中，ERK1/2是細(xì)胞增殖、分化關(guān)系極為密切的、細(xì)胞內(nèi)許多信號共同的信息通路和交匯點(diǎn)，這引起了心血管研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。以轉(zhuǎn)基因高血壓鼠和正常血壓鼠為研究對象，檢測AngII介導(dǎo)的MAPK家族信號物質(zhì)活性變化與心肌肥厚相關(guān)性，結(jié)果顯示ERK1/2在AngII引起的血壓變化過程中活性明顯增高，ERK1/2與心肌肥厚進(jìn)展關(guān)系密切，但其確切機(jī)制尚不完全清楚［11］。

CREB作為細(xì)胞內(nèi)的第三信使，是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子大家族中的一員。CREB蛋白的生物學(xué)活性受磷酸化的調(diào)控，CREB分子是多種蛋白激酶的磷酸化底物，如 PKA、MAPK、PKC、CaMKs、CK 等都可以磷酸化CREB蛋白KID區(qū)的Ser133。當(dāng)CREB蛋白的Ser133被磷酸化后，可以被CBP蛋白特殊的結(jié)構(gòu)域特異性地識別并結(jié)合，可以使啟動(dòng)子序列上的CRE元件乙?；?，同時(shí)啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。ERK1/2可通過激活CREB核糖體S6激酶(Rsk)來激活轉(zhuǎn)錄因子 CREB，從而作用于 cAMP反應(yīng)元件(CRE)，啟動(dòng) CRE依賴性的轉(zhuǎn)錄。此外，ERK1/2也可直接磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB［12］。

本實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證AngII刺激ERK1/2磷酸化位點(diǎn)在 Thr202/Tyr204上，因此應(yīng)用了 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)特異性抗體，用不同濃度的AngII作用 5 min，AngII劑量依賴的增加 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的蛋白表達(dá)，以 10－6、10－7mol·L－1濃度效果較佳。為了驗(yàn)證AngII刺激CREB磷酸化位點(diǎn)在 Ser133上，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 p-CREB(Ser133)特異性抗體，AngII劑量依賴的增加 p-CREB(Ser133)的蛋白表達(dá)，以10－6、10－7mol·L－1濃度效果較佳。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) AngII刺激細(xì)胞時(shí)ERK1/2磷酸化水平升高很明顯。同時(shí)，ERK1/2下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的 CREB表達(dá)亦有升高，而CREB蛋白無明顯變化，這表明AngII可通過激活MAPK-ERK1/2途徑，刺激CREB的激酶誘導(dǎo)域，使CREB磷酸化而具有轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，引起心肌肥厚。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2劑量依賴的降低AngII刺激心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白和p-CREB蛋白表達(dá)增加，說明F2抑制AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制可能與通過抑制MAPK-ERK1/2-CREB有關(guān)，但是其詳細(xì)機(jī)制以及因果關(guān)系需進(jìn)一步的研究得以確證。

綜上所述，F(xiàn)2能抑制AngII刺激心肌細(xì)胞的肥大。本研究拓展了F2的作用靶點(diǎn)，存在潛在的治療價(jià)值，為其研發(fā)積累了更進(jìn)一步的藥理學(xué)證據(jù)。

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