陳海鳴，李學(xué)明，劉志堅，鄒俊，李江濤，王聯(lián)群

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，南昌330006)

膿毒癥(sepsis)是外科極為常見的一種疾病，無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家都是最常見的。 膿毒癥病情兇險，病死率高，治療成本高昂，發(fā)病率為每年70-240 人/10 萬[1，2]，且呈逐年增長，估計到2020 年將新增約100 萬膿毒癥病例[3，4]。 膿毒癥的發(fā)病機制十分復(fù)雜， 構(gòu)建出理想的臨床相關(guān)性膿毒癥模型也就一直成為膿毒癥研究的難點[5-7]。 本研究采用升結(jié)腸支架置入腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis，CASP)模型，為研究膿毒癥的發(fā)病機制提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級Balb/c 雄性小鼠共60 只，6-8 周齡，體重23-27 g/只，實驗前所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。實驗小鼠分5組，正常對照組，假CASP 組，CASP 組，其中CASP組按照支架的直徑不同分為3 組：CASP 14GA 組[BD14GA(2.0×45mm2, 270 ml/min)]，CASP 16GA 組[BD16GA(1.7×45mm2, 180 ml/min)]，CASP 18GA 組[BD18GA(1.2×45mm2, 80 ml/min)]，每組動物12 只。

1.2 CASP 模型的制作 3 組CASP 模型分別采用靜脈輸液的18GA、16GA 和14GA3 種規(guī)格BD 針做插管支架， 從尖端環(huán)形切掉塑料圓管2mm 距離切端1cm 處用剪刀壓榨一小溝， 但不切破塑料壁管壁備用。 抽取20 g/L 戊巴比妥鈉，按50mg/kg 進行小鼠腹腔麻醉，沿腹中線切開腹腔，用棉簽仔細地將盲腸、末端回腸、升結(jié)腸從腹腔輕輕拔出，距盲腸末端15mm， 用BD 針支架離4-0 薇喬線1-2mm 戳穿升結(jié)腸并進入結(jié)腸1cm， 用4-0 薇喬線縫合固定在升結(jié)腸腸壁上， 用棉簽朝著塑料支架仔細擠出腸內(nèi)容物， 直到支架的末端有一點糞便流出，把內(nèi)臟放回腹腔，腹腔給予37℃的0.5ml 生理鹽水復(fù)蘇，關(guān)閉腹膜、皮膚。假CASP 組將塑料支架用縫線固定在升結(jié)腸系膜后將結(jié)腸回納入腹腔，其余手術(shù)過程同CASP 組。 正常對照組為不做任何操作組。

1.3 觀察指標 (1)術(shù)后一般表現(xiàn)；(2)不同管徑支架的CASP 模型的生存時間及生存率；(3)各器官HE染色行組織病理學(xué)的檢測；(4) 腹腔分泌物微生物實驗室檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier 方法和Log-rank 檢驗評價各小組生存率，P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般表現(xiàn) 12h 后CASP 各組均逐漸出現(xiàn)豎毛、蜷縮、少動、少食、呼吸減弱、體溫下降，嚴重者可見眼角分泌物較多及顫抖， 但CASP18GA 組的癥狀出現(xiàn)時間最晚，癥狀最輕， CASP16GA 組的癥狀出現(xiàn)時間其次， 癥狀較重，CASP14GA 組的癥狀出現(xiàn)時間最早，癥狀最重。

2.2 不同管徑支架的CASP 模型的生存時間 術(shù)后18h 開始觀察到小鼠死亡，CASP 各組小鼠的生存時間取決于置入支架的管徑， 置入支架管徑越小生存時間越長， 其中CASP14GA 組小鼠平均存活時間為(28.800±2.752)h，CASP16GA 組小鼠平均存活時間為(84.200±21.758)h，CASP18GA 組小鼠平均存活時間為(113.200±21.270)h。 應(yīng)用Log-rank檢驗進行生存分析顯示不同管徑CASP 實驗組間有 顯 著 性 差 異 (n=10，P=0.009，χ2=9.531)，CASP 14GA 組、CASP16GA 組、CASP18GA 組與假CASP組和正常對照組有顯著性差異(n=10，P<0.001，χ2=74.524)。 見表1。

表13 種管徑支架的CASP模型的生存時間比較

2.3 CASP 實驗組各器官HE 染色 (1)肺臟：CASP實驗組肺間隔明顯增寬，肺泡壁小血管擴張充血，多灶出血，炎細胞浸潤；(2)肝臟：肝臟匯管區(qū)增寬，小葉間血管擴張，炎性細胞浸潤；(3)腸：CASP 實驗組小腸粘膜可見回腸黏膜糜爛壞死， 腸腔內(nèi)大量的炎性滲出物和脫落壞死的腸黏膜上皮， 絨毛明顯萎縮，間質(zhì)血管擴張，大量的炎性細胞浸潤；(4)腎臟：腎小球毛細血管袢擴張充血，球囊腔狹窄。腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性。 腎間質(zhì)水腫，血管擴張充血；(5)脾臟：脾竇增寬，擴張充血，炎細胞浸潤，局部灶性出血。 白髓淋巴組織增生，淋巴濾泡形成；(6)心臟：心肌片狀水腫，心臟間質(zhì)炎性細胞浸潤，間質(zhì)血管充血。

2.4 腹腔分泌物微生物實驗室檢查 假CASP 組、正常對照組均未檢測到細菌生長，CASP 實驗組腹腔內(nèi)分泌物培養(yǎng)均檢測到典型的腸道細菌如革蘭陰性大腸埃希氏菌、桿菌種、腸球菌等。

3 討論

盡管近十年來膿毒癥實驗與臨床研究方興未艾，但膿毒癥的致病機制仍未闡明[5，7]。 膿毒癥的動物模型的構(gòu)建大大促進了人們對膿毒癥發(fā)病機制的認識。 其中盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模型(cecal ligationperforation，CLP) 被認為是進行膿毒癥研究的金標準[8-9]。 自1978 年以來得到廣泛的應(yīng)用，然而研究發(fā)現(xiàn)該模型仍具有自身的缺陷， 主要表現(xiàn)為CLP模型在穿孔后包裹感染灶，使得感染局限化，有的甚至完全恢復(fù)， 從而不會進展到膿毒癥及膿毒癥休克。 為此，本研究采用升結(jié)腸支架置入至腹膜炎的膿毒癥動物模型。

CASP 模型構(gòu)建是將一個固定管徑的支架植入鼠的升結(jié)腸， 使糞便持續(xù)滲漏到腹膜腔中并形成腸道細菌感染，導(dǎo)致腹腔膿腫和彌漫性腹膜炎，病理變化與臨床上腸瘺的病理變化過程相似，都是破壞宿主屏障， 造成細菌易位， 引發(fā)炎癥的模型。 本研究分別采用3 種不同管徑的支架構(gòu)建CASP 模型，小鼠均表現(xiàn)明顯的膿毒癥及膿毒性休克的癥狀，出現(xiàn)豎毛、蜷縮、呼吸減弱、體溫下降等癥狀，小鼠腹腔有明顯的炎癥征象，小腸部分壞死發(fā)黑，腹腔炎癥嚴重，明顯滲液，腹腔內(nèi)分泌物培養(yǎng)出腸道細菌， 進一步組織病理切片結(jié)果顯示小腸黏膜明顯壞死脫落，絨毛萎縮，心、肺、腎、脾臟有大量的炎性細胞浸潤等炎癥表現(xiàn)，CASP 模型各組小鼠的生存時間及炎癥程度取決于置入支架的直徑， 支架直徑越大炎癥越重。 本研究結(jié)果顯示CASP 模型可以彌補CLP 模型持續(xù)性腹腔內(nèi)感染不足的缺點，重現(xiàn)了急性多細菌性膿毒癥腹膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程，對于探討膿毒癥的病理生理學(xué)及機制的研究無疑具有重要意義。 本實驗操作簡單，具有可重復(fù)性，可以模仿人類彌漫性腹膜炎疾病過程， 適用于外科膿毒癥的研究。

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