梁國威，宋 燕，邵冬華，徐 旭，何美琳

（航天中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100049）

MicroRNA（miRNA）是一組由19－24個(gè)核苷酸組成，含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，其主要通過與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)完全或不完全的堿基互補(bǔ)結(jié)合，在蛋白質(zhì)翻譯水平上進(jìn)行調(diào)控［1－2］。目前，大量的研究顯示 miRNA在心血管、感染、腫瘤以及糖尿病等疾病過程中呈現(xiàn)特異性的表達(dá)并起到重要作用［3－4］。

目前，在2型糖尿?。―M）患者循環(huán)血液中miRNA的變化情況已有文獻(xiàn)報(bào)道。Zampetaki A等［5］通過基因芯片掃描和熒光定量PCR檢測(cè)確證，在DM患者血循環(huán)中有13個(gè)miRNA表達(dá)異常，其中 miR－15a、miR－29b、miR－126、miR－223表達(dá)下調(diào)和miR－28－3p表達(dá)上調(diào)在2型糖尿病早期即可發(fā)生。Kong L等［6］通過文獻(xiàn)檢索選擇7個(gè)miRNA，并進(jìn)一步檢測(cè)了它們?cè)贒M前期和新發(fā)DM患者血清中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR－9、miR－29a、miR－34a、miR－146a、miR－375在新發(fā)DM患者中表達(dá)皆顯著高于健康對(duì)照和糖尿病前期組。但在DM患者中，疾病相關(guān)miRNA表達(dá)變化和糖、脂標(biāo)志物的相關(guān)性研究國內(nèi)外未見研究報(bào)道。本研究經(jīng)文獻(xiàn)檢索選擇miR－375和miR－29a作為標(biāo)志物，通過檢測(cè)其血清中表達(dá)情況，探討上述2個(gè)標(biāo)志在初診DM患者中表達(dá)差異，及其變化與糖、脂標(biāo)志物的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 收集2011年12月－2012年3月我院資料完整的健康體檢者者，并根據(jù)體檢者自述排除既往已確診的DM的體檢者，按1999年WHO的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均行75克葡萄糖（OGTT）實(shí)驗(yàn)，根據(jù)空腹血糖（FPG）和2 h血糖（2 hPG）將研究對(duì)象分為糖代謝正常組和DM組。具體標(biāo)準(zhǔn)為：健康對(duì)照組：FPG＜6.1 mmol／L和2 h PG＜7.8 mmol／L；DM 組：FPG ≧ 7.0 mmol／L和／或2hPG ≧11.1 mmol／L。通過篩查共分為2組，2型糖尿病患者組（DM組）：48例，男27例，女21例，年齡35－72歲（平均54.9±9.8歲）；健康對(duì)照組：38例，男22例，女16例，年齡40－72歲（平均55.0±9.3歲）。

1.2 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) （1）臨床基本資料調(diào)查：由專人調(diào)查體檢人員的身高、體重，并計(jì)算體重指數(shù)（BMI）；血壓測(cè)量方法為休息15min后坐位測(cè)量右上臂肱動(dòng)脈收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），取3次測(cè)量平均值。（2）實(shí)驗(yàn)室檢查：空腹10 h后，使用真空采血管（美國BD公司提供）抽取空腹及服糖后2 h肘靜脈血，血液離體2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。采用全自動(dòng)生化分析儀（AU2700，Olympus，日本）測(cè)定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、FPG 和2h PG，試劑由日本OLYMPUS公司配套提供。糖化血紅蛋白（Hb A1c）采用高效液相色譜法（HLC－73G7，Tosoh，日本）測(cè)定。

1.3 血清miRNA提取 采用mir Vana PARIS RNA試劑盒（編號(hào)AM1556，ABI公司，美國），取6 h內(nèi)空腹新鮮血清400μl，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，提取100μl總RNA，RNA提取后立即－80℃保存。

1.4 miRNA相對(duì)定量檢測(cè) （1）逆轉(zhuǎn)錄：采用Taqman microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（編號(hào)4366596，ABI公司，美國），在Gene Amp 9700 PCR儀（ABI公司，美國）上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系15μl，包括：提取總 RNA按1∶1稀釋后取5μl，100 m M d NTPs 0.15μl，MultiScribe Reverse Transcriptase 1μl，10×Reverse Transcription Buffer 1.5μl，RNase Inhibitor 0.19μl，水4.16μl，逆轉(zhuǎn)錄引物3 μl。反應(yīng)條件為：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃ ∞，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（c DNA）立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：采用7500 Real Time PCR System（ABI公司，美國），每個(gè)cDNA樣本同時(shí)檢測(cè)3次，循環(huán)閾值（Ct值）取3次平均值。反應(yīng)體系20μl，包括：cDNA按1∶1稀釋后取5μl，Taq Man Universal Master Mix II（ABI公司，美國）10μl，水4μl，引物及探針1μl。循環(huán)條件為：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所用引物和探針由美國ABI公司提供，編號(hào)分別是：RNU6B：001093；hsa－miR－375：000564；hsa－miR－29a：002112。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 由于RNU6B（非編碼小RNA）作為內(nèi)參基因被廣泛應(yīng)用于miRNA研究之中［6］，本研究選擇RNU6B作為內(nèi)參基因。miR－29a和miR－375相對(duì)表達(dá)量以 △Ct表示，△Ct為目的基因Ct值與RNU6B Ct值的差值。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，其中不符合正態(tài)分布者以中位數(shù)（25%，75%）表示，并取自然對(duì)數(shù)后進(jìn)行組間比較。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05做為差別有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本資料

DM組和對(duì)照組的FPG分別為5.1±0.5 mmol／L和8.8±1.55.1 mmol／L、2hPG 分別是6.7±0.5 mmol／L和15.4±4.3 mmol／L，Hb A1c是5.6±0.3%和8.4±1.5%，DM 組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。與對(duì)照組比較，DM 組的BMI、SBP、DBP、TG、HDL－C 顯 著 高 于 對(duì) 照 組 （P＜0.05）。對(duì)照組和DM 組間的性別、年齡、TC、LDLC無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 研究對(duì)象的基本資料

2.2 外周血中 miR－29a、miR－375的ΔCt值變化情況

miR－29a在對(duì)照組和DM組血清中ΔCt值分別是－9.15±1.29和10.2±1.45，DM 組血清中miR－29a表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＝0.001）；miR－375在對(duì)照組和DM組血清中ΔCt值分別是－5.76±1.1.67和－7.18±1.93，DM 組中的 miR－375表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＝0.001）。

用對(duì)照組和DM組外周血中的△Ct平均值計(jì)算差值（△△Ct值），miR－29a的△△Ct值為1.05，計(jì)算2△△ct＝2.07，即DM患者外周血中miR－29a表達(dá)量約為正常人的2.07倍，同理，miR－375的△△Ct值為1.42，DM患者外周血中miR－375表達(dá)量約為正常人的2.68倍。

2.3 血清中 miR－29a、miR－375的 ΔCt值與糖、脂檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

所有研究對(duì)象（n＝86例）中的相關(guān)分析顯示，miR－29a的ΔCt值與TG、TC、HDL－C、LDL－C皆無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與FPG（r＝－0.422，P＜0.001）、2hPG（r＝－0.417，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.548，P＜0.001）顯著負(fù)相關(guān)，顯示隨FPG、2hPG和Hb A1c升高血清中miR－29a的表達(dá)量顯著增加；miR－375的 ΔCt值與 TG、TC、HDL－C、LDL－C也皆無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與FPG（r＝－0.400，P＜0.001）、2hPG（r＝ －0.464，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.588，P＜0.001）也顯著負(fù)相關(guān)，顯示隨FPG、2h PG和 Hb A1c升高血清中miR－375的表達(dá)量也顯著增加。見表2。

表2 miR－29a、miR－375的ΔCt值與糖、脂檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 miR－29a和miR－375的ΔCt值相關(guān)性分析

所有研究對(duì)象（n＝86例）中的相關(guān)分析顯示，miR－29a和 miR－375的 ΔCt值的相關(guān)系數(shù)r＝0.828，P＜0.001，顯示 miR－29a和 miR－375在 DM患者血清中表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性。

3 討論

胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病發(fā)病的兩大機(jī)制。本研究選擇在初診2型糖尿病患者血清中檢測(cè)miR－29a和miR－375，是由于大量基礎(chǔ)研究皆顯示miR－29a和miR－375與胰島β細(xì)胞分化、胰島素表達(dá)和分泌，以及血糖水平變化和胰島素抵抗等2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素具有顯著關(guān)系。

研究顯示，miR－29a在血糖刺激的胰島素分泌和胰島素抵抗中起重要作用。He A［7］等人的研究標(biāo)明，在糖尿病小鼠的骨骼肌、脂肪組織和肝臟中miR－29a表達(dá)明顯上調(diào)。相反，在3T3－L1脂肪細(xì)胞中通過高表達(dá)miR－29a可顯著抑制胰島素刺激的血糖吸收，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。最新研究顯示，血糖水平變化可顯著上調(diào)人和鼠的胰島β細(xì)胞中miR－29a表達(dá)，而miR－29a表達(dá)上調(diào)可顯著降低血糖刺激的胰島素分泌。由于下調(diào)miR－29a表達(dá)可顯著提高胰島β細(xì)胞的分泌功能，提示miR－29a表達(dá)上調(diào)在糖代謝紊亂至糖尿病的發(fā)展過程起重要作用［8］。

miR－375在胰島β細(xì)胞分化和胰島素分泌中起重要作用。在miR－375基因敲除的小鼠模型中［9］，胰島β細(xì)胞分化受損而減少，出現(xiàn)高血糖癥，胰腺α細(xì)胞生成增加，糖異生和肝糖輸出增加，提示miR－375在維持血糖穩(wěn)態(tài)、胰島α和β細(xì)胞生長，以及由胰島素抵抗所致胰島β細(xì)胞分化方面具有中重要作用。進(jìn)一步研究標(biāo)明［10］，在胰島β細(xì)胞中高表達(dá)的miR－375可能通過作用于肌侵蛋白（Myotrophin）抑制血糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。相反，抑制miR－375表達(dá)可加強(qiáng)胰島素分泌，顯示miR－375對(duì)胰島素的分泌有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。而El Ouaamari A等［11］研究顯示，miR－375可直接抑制3′－磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的翻譯，降低血糖刺激的胰島素基因表達(dá)和合成，高血糖則可升高PDK1蛋白表達(dá)并同時(shí)降低miR－375表達(dá)。

盡管在組織和器官中 miR－29a和miR－375與糖代謝相關(guān)因素關(guān)系的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，由于認(rèn)識(shí)上的局限性，2008年才首次發(fā)表了血清中存在大量的 miRNA［12－13］。目前，血清中 miR－29a和miR－375表達(dá)變化與糖尿病的相互關(guān)系研究報(bào)道較少。Kong L等［6］在血清中的研究顯示，與健康對(duì)照組和糖尿病前期組比較，在新診斷的2型糖尿病患者血清中 miR－29a和 miR－375表達(dá)皆顯著上調(diào)。我們的研究除證實(shí)2型糖尿病患者血清中miR－29a和 miR－375皆表達(dá)上調(diào)外，miR－29a和 miR－375表達(dá)量的變化與空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c具有顯著的正相關(guān)性，提示miR－29a和miR－375在血清中表達(dá)變化有可能作為診斷2型糖尿病的分子標(biāo)志物，或從治療的角度作為2型糖尿病患者治療新的分子靶點(diǎn)。

盡管有基礎(chǔ)研究顯示，miR－375可在脂肪細(xì)胞分化過程中起重要作用［14］。本研究顯示，血清中miR－375表達(dá)量的變化與 TG、TC、HDL－C、LDL－C皆無顯著相關(guān)性。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道高血糖可刺激脂肪細(xì)胞中 miR－29a的高表達(dá)［15］，但 miR－29a與脂肪細(xì)胞分化、脂肪代謝的相關(guān)性未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究也證實(shí)血清miR－29a表達(dá)量與血脂各指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

由于每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)［1，2］。我們研究結(jié)果顯示血清中miR－29a和miR－375表達(dá)量的變化具有顯著正相關(guān)性，提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中可能具有協(xié)同調(diào)控作用，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)DM患者血清中的miR－29a和miR－375表達(dá)量皆顯著高于對(duì)照組。血清中miR－29a和 miR－375表達(dá)量的變化與空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c呈顯著正相關(guān)，提示miR－29a和miR－375在血清中表達(dá)變化有可能作為診斷2型糖尿病的分子標(biāo)志物。而血清中miR－29a和miR－375表達(dá)量的變化具有顯著正相關(guān)性提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中可能具有協(xié)同調(diào)控作用。

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