金呈強(qiáng)，董海新＊，劉 仿

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272029；2.廣東醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)教研室，廣東 湛江 524023）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP），又稱自身免疫性血小板減少性紫癜（autoimmune thrombocytopenic purpura，AITP），是因免疫機(jī)制使血小板破壞增多的臨床綜合征，是較為常見(jiàn)的出血性疾病，也是最常見(jiàn)的一種血小板減少性紫癜［1］。為探討ITP模型小鼠體內(nèi)NO／NOS對(duì)ROS生成影響的作用，我們使用NO供體藥物硝普鈉稀釋液腹腔注射ITP模型小鼠后，用ELISA法分析不同時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血中NO／NOS和ROS濃度的變化情況。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

同齡SPF級(jí)云南昆明小鼠46只，雌雄兼用，體重（20±6）g，購(gòu)于廣東醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

注射用硝普鈉（規(guī)格：50 mg；北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司）；NO及NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所第一分所），F(xiàn)enton反應(yīng)活性氧（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 ITP模型的建造

將小鼠抗人C反應(yīng)蛋白（CRP）單抗、人血清白蛋白和抗小鼠血小板膜糖蛋白（GPIIb／IIIa）單抗（MWReg30）以一定比例混合后裝入微型滲透泵，將其植入小鼠皮下組織，使MWReg30以0.25μl／h的速度持續(xù)緩慢地釋放至小鼠體內(nèi)（持續(xù)14天）［2］。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將注射用硝普鈉50 mg（1支）溶解于50 ml生理鹽水溶液中備用。將模型小鼠隨機(jī)分為2組：NO供體藥物硝普鈉（SNP）組和磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)照組，SNP組用相同濃度（1 mg／ml）的 NO供體藥硝普鈉稀釋液0.5 ml進(jìn)行腹腔注射，PBS對(duì)照組使用相同體積的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行腹腔注射，用藥第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min后（每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)至少3只）取血。具體方法為用乙醚麻醉小鼠后，進(jìn)行頸動(dòng)、靜脈分離手術(shù)，待頸動(dòng)脈暴露清楚后，使用注射器刺入動(dòng)脈血管，抽取3 ml血量，離心分離血清，用ELISA法分別檢測(cè)血清中NO、NOS和ROS的含量。

1.5 ELISA法檢測(cè)NO含量、總NOS活性及ROS濃度

收集分離后的血清，嚴(yán)格按照硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量。蒸餾水調(diào)零，于550 nm，0.5 cm光徑測(cè)量各管吸光度值，計(jì)算出NO的濃度，以μmol／L表示。嚴(yán)格按照一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，分光光度計(jì)530 nm處，1 cm光徑，測(cè)各管的吸光度值，計(jì)算出總NOS的濃度，以U／ml表示。ROS濃度嚴(yán)格按照Fenton反應(yīng)活性氧（ROS）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，以蒸餾水調(diào)零，于550 nm、0.5 cm光徑測(cè)定各管的吸光度值，計(jì)算ROS濃度，以U／ml表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)用（±s）表示，均經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)程度用直線相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP對(duì)ITP模型小鼠NO含量的影響

如表1所示，PBS對(duì)照組NO含量的測(cè)定結(jié)果各不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值無(wú)顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min檢測(cè)的NO含量逐漸升高，各測(cè)量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗(yàn)組在第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min測(cè)量結(jié)果和 PBS對(duì)照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

2.2 SNP對(duì)ITP模型小鼠NOS活性的影響

如表2所示，對(duì)照組NOS活性的測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min檢測(cè)的 NOS活性逐漸升高，各測(cè)量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗(yàn)組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min測(cè)量結(jié)果和對(duì)照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

2.3 SNP對(duì)ITP模型小鼠ROS濃度的影響

如表3所示，ROS濃度在PBS對(duì)照組中各測(cè)量值之間無(wú)顯著性差異（均P＞0.05），而SNP組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min檢測(cè)的ROS濃度逐漸升高，各測(cè)量值之間有著顯著性差異（均P＜0.05），試驗(yàn)組在第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min測(cè)量結(jié)果和PBS對(duì)照組相比有著顯著性差異（均P＜0.05）。

表1 SNP對(duì)ITP模型小鼠NO含量的影響檢測(cè)結(jié)果（±s，單位：μmol／L）用藥時(shí)間5 min 15 min 25 min 35 min 45 min SNP組 16.70±2.53△ 19.12±3.52△ 25.44±2.08△ 29.85±5.21△ 32.47±6.28△PBS對(duì)照組 7.44±2.85 7.43±2.04 7.19±1.89 7.83±2.19 7.88±1.32 SNP組和PBS對(duì)照組相比，△P＜0.05；下同。

表2 SNP對(duì)ITP模型小鼠NOS活性的影響檢測(cè)結(jié)果（±s，單位：U／ml）用藥時(shí)間5 min 15 min 25 min 35 min 45 min SNP組 0.806±0.120△ 1.058±0.262△ 1.427±0.243△ 1.824±0.320△ 2.041±0.288△PBS對(duì)照組 0.413±0.088 0.461±0.057 0.454±0.032 0.420±0.014 0.484±0.051

?

2.4 ROS濃度與NO含量的相關(guān)性分析

ITP模型小鼠外周血ROS濃度與NO含量在加入藥物硝普鈉后第5 min，15 min，25 min，35 min和45 min均上升，如圖1所示。在用藥后ROS濃度變化與NO含量呈正相關(guān)（r＝0.76，P＜0.01）。

2.5 ROS濃度與NOS活性的相關(guān)性分析

ITP模型小鼠外周血ROS濃度與NOS活性在加入藥物硝普鈉后第5 min，15 min，25 min，35 min、45 min均上升，如圖2所示。在用藥后ROS濃度變化與NOS活性呈正相關(guān)（r＝0.82，P＜0.01）。

3 討論

圖1 NO含量和ROS濃度隨著用藥后不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

特發(fā)性血小板減少性紫癜是一種獲得性器官特異性自身免疫性疾病，臨床治療上以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。本課題組曾用流式細(xì)胞儀檢測(cè)急性ITP患者外周血PAIgG和Tr細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)PAIgG含量明顯升高，而Tr細(xì)胞的數(shù)量明顯降低［3］。另外一些細(xì)胞因子也參與了該病的病理過(guò)程，如IL－7水平升高在AITP發(fā)病中具有重要作用，機(jī)制為降低有效免疫抑制作用，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少，促進(jìn)了血小板破壞［4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在Jurkat系T腫瘤細(xì)胞中，在沒(méi)有外在改變腫瘤細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）的前提下，隨著過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ（PPAR－γ）的活化劑曲格列酮作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞NO含量相應(yīng)地增長(zhǎng)［5］，隨后我們以特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）模型小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)曲格列酮以一種時(shí)間依賴的形式增加該模型小鼠血清中一氧化氮的含量，NO信號(hào)途徑在PPAR－γ的免疫調(diào)節(jié)功能中起到了一定的作用［6］。

急性期血栓性血小板減少性紫癜（TTP）的血漿能夠誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞的ROS的產(chǎn)生，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá)，血液中吞噬細(xì)胞的激活可能參與TTP的病理生理過(guò)程［7］。Ruiz－Torres MP發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致血栓性微血管?。═MA）事件中的核心因素，在該疾病的急性相中性粒細(xì)胞釋放過(guò)量的活性氧，參與了血栓性微血管病的釋放［8］。另外TNF－α能夠顯著增強(qiáng)免疫球蛋白誘導(dǎo)純化的嗜中性粒細(xì)胞中ROS的釋放［9］。在自身免疫性血小板減少癥中，鐵離子可以誘導(dǎo)活性氧（ROS）的生成，鐵超載導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生過(guò)剩［10］，而高濃度活性氧也可能對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制和殺傷作用［11］。

圖2 NOS活性和ROS濃度隨著用藥后不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

綜上所述，氧化應(yīng)激和自由基可能在慢性ITP的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用，但至今尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。而本研究發(fā)現(xiàn)在慢性ITP小鼠模型中，外用NO供體藥物硝普鈉后，其外周血中ROS水平明顯升高，且有時(shí)間依賴性，另外NO、NOS均與ROS呈正相關(guān)，提示ROS在ITP病理發(fā)展中可能與NO具有協(xié)同作用，該效應(yīng)可能會(huì)加重血小板的破壞過(guò)程，導(dǎo)致病情的進(jìn)一步惡化發(fā)展，NO／NOS、ROS的檢測(cè)對(duì)慢性ITP的診治具有潛在的臨床指導(dǎo)意義。

［1］王香梅，金 萊，胡慧仙，等.聯(lián)合檢測(cè)血小板相關(guān)抗體及T細(xì)胞亞群在血小板減少性紫癜中的臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2007，11（1）：127.

［2］宋 麗，金呈強(qiáng)，劉 仿.ITP動(dòng)物模型建立方法的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際免疫學(xué)雜志，2009，36（5）：45.

［3］金呈強(qiáng)，董海新，劉 仿，等.急性特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒外周血血小板抗體、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平的檢測(cè)及臨床意義［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（10）：1073.

［4］金呈強(qiáng)，劉 仿，宋麗，等.急性ITP患兒外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr細(xì)胞、IL－7水平變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（11）：4.

［5］金呈強(qiáng)，劉 仿，肖 紅，等.活化的PPAR－γ對(duì)Jurkat系T腫瘤細(xì)胞 NO生成誘導(dǎo)的研究［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2008，24：6.

［6］王文龍，金呈強(qiáng)，劉仿，等.PPAR－γ配體對(duì)ITP模型小鼠NO生成誘導(dǎo)時(shí)間效應(yīng)的研究［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2010，26（7）：591.

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［11］馬 波，趙吉生.胃癌患者外周血中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的臨床意義［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2001，5（4）：180.