霍海龍， 趙 躍， 王 銳， 李衛(wèi)真， 張永云， 劉麗仙， 王 配， 苗永旺，錢(qián)林東， 字榮英， 霍金龍

(1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，云南 昆明650031;2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650091;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201;4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南 昆明650201)

白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL6)是一種由淋巴類(lèi)及非淋巴類(lèi)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的能夠促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和分化以及促進(jìn)IgM 向其他免疫球蛋白(如IgG)轉(zhuǎn)化的蛋白，其在機(jī)體的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、急性期應(yīng)答反應(yīng)和造血過(guò)程中均起著重要的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最為廣泛的細(xì)胞因子之一［1-2］。最近的研究顯示IL6 可以作為動(dòng)物的免疫輔佐劑，而且已經(jīng)成功地用來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的免疫應(yīng)答反應(yīng)［3］。

干擾素(Interferon-α，IFNα)是一類(lèi)在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫激活功能活性的細(xì)胞因子［4］。哺乳動(dòng)物的干擾素分為兩大類(lèi)，IFNα屬于Ⅰ型干擾素，主要作用是抑制病毒的增殖和擴(kuò)散、增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平等［5］。由于IFNα具有廣譜抗病毒活性，目前基因工程重組IFNα 制劑已作為抗病毒生物制劑應(yīng)用于人醫(yī)臨床［6］。

由于細(xì)胞因子可高效調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)且具有多向性、網(wǎng)絡(luò)性等特征，而且各種細(xì)胞因子之間具有相互協(xié)調(diào)和相互制約的作用，許多研究者利用基因工程技術(shù)將功能類(lèi)似或互補(bǔ)的細(xì)胞因子進(jìn)行組合，產(chǎn)生出很多高效多功能的融合蛋白［7-9］。就豬IL6、IFNα 來(lái)看，目前雖有一些表達(dá)質(zhì)粒作為分子免疫佐劑調(diào)節(jié)免疫水平和疫苗免疫應(yīng)答的報(bào)道［7-11］，但國(guó)內(nèi)對(duì)豬IL6 和IFNα 基因經(jīng)過(guò)融合重組作為分子免疫增強(qiáng)劑的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究將應(yīng)用PCR 方法克隆出豬IL6 和IFNα 成熟肽基因，并首次開(kāi)展豬IL6-Linker-IFNα 嵌合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌的誘導(dǎo)表達(dá)，為IL6-Linker-IFNα 蛋白在豬體內(nèi)抗病毒應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、菌株及質(zhì)粒

小量質(zhì)粒提取試劑盒(DV801A)、瓊脂糖膠回收試劑盒(DV805A)以及Premix 預(yù)混合Taq 酶、pMD?18-T 載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、氨芐(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷(X-Gal)、限制性?xún)?nèi)切酶(XhoⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ)、DL2000 DNA Marker 和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);pET32a 表達(dá)載體和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta (DE3)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

利用IL6-F1/R1 和IFNα-F1/R1 分別擴(kuò)增出IL6 和IFNα 基因完全編碼序列，并分別與pMD18載體連接后克隆測(cè)序，參照測(cè)序結(jié)果，并綜合考慮表達(dá)載體pET32a 序列，設(shè)計(jì)IL6-F2/R2 和IFNα-F2/R2 引物，并在IL6-F2 引物上加NdeⅠ酶切位點(diǎn)，在IL6-R2 引物上加X(jué)hoⅠ酶切位點(diǎn)和Linker 序列，在IFNα-F2 引物上加X(jué)hoⅠ酶切位點(diǎn)和Linker 序列，在IFNα-R2 引物上加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和His 標(biāo)簽序列。引物信息見(jiàn)表1，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 IL6 和IFNα 編碼區(qū)序列擴(kuò)增

反應(yīng)體系12.50 μl:6.25 μl 的Premix(2 ×預(yù)混和試劑)，10 μmol/L 引物F1/R1 各0.25 μl，0.50 μl 25 ng/μl 豬cDNA 池，5.25 μl ddH2O。擴(kuò)增條件為:94 ℃3 min;94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.4 目的基因和載體連接、轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)

利用瓊脂糖膠回收試劑盒純化目的片段，將其與pMD18 載體連接，反應(yīng)體系10 μl:1 μl pMD18 載體，4 μl 目的片段，5 μl 連接緩沖液。恒溫循環(huán)水浴16 ℃連接16.0 h。全量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α 感受態(tài)細(xì)胞，加入LB 液體培養(yǎng)基(Amp－)800 μl，37 ℃，振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)1.0 h，取100 μl 涂布于含有X-Gal(40 μg/ml)、IPTG(23.8 μg/ml)、Amp(100 μg/ml)的LB 瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，形成單菌落。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒PCR 鑒定和測(cè)序

用滅菌牙簽挑取生長(zhǎng)孤立的白色陽(yáng)性菌落，接種于含4 ml LB 液體培養(yǎng)基(Amp+)的玻璃管里，37℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)16.0 h。之后，參照說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。以0.5 μl 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 鑒定，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與原PCR 反應(yīng)體系和條件相同。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 IL6 和IFNα 成熟肽基因的克隆和鑒定

利用IL6-F2/R2 和IFNα-F2/R2 擴(kuò)增IL6 和IFNα 成熟肽基因，PCR 擴(kuò)增體系和條件、回收純化、連接、轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和培養(yǎng)、質(zhì)粒PCR 鑒定、測(cè)序鑒定同上，用NdeⅠ/EcoRⅠ和XhoⅠ/SalⅠ分別雙酶切確定IL6 基因、XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切確定IFNα 基因是否已分別克隆到pMD18 載體中，并將陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因公司利用通用引物M13 進(jìn)行測(cè)序鑒定，將確定正確重組的質(zhì)粒分別命名為pMD18-IL6 和pMD18-IFNα。

表1 IL6 和IFNα 基因的PCR 引物Table 1 PCR primers for genes IFNα and IL6

1.7 IL6-IFNα 融合基因原核表達(dá)載體pET32a-IL6-IFNα 的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和Xho Ⅰ對(duì)pMD18-IL6 和pMD18-IFNα 分別進(jìn)行酶切，回收只含IFNα 的基因片段和含IL6 基因的pMD18 載體片段(pMD18-IL6)，并將兩者連接在一起(連接的反應(yīng)體系同方法1.4)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-IL6-IFNα。用NdeⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切pMD18-IL6-IFNα 和pET32a，回收目的片段并使之連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-IL6-IFNα，用PCR 法和酶切法進(jìn)行鑒定。PCR 反應(yīng)體系同上，上、下游引物分別用IL6-F2 和IFNα-R2;使用NdeⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.8 pET32-IL6-IFNα 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)及融合蛋白的表達(dá)

1.8.1 不同終濃度IPTG 誘導(dǎo)pET32-IL6-IFNα 重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒pET32a-IL6-IFNα 和對(duì)照質(zhì)粒pET32a 先均轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株DH5α，培養(yǎng)16.0 h。分別挑取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株Rosetta(DE3)，分別挑取含有重組質(zhì)粒pET32a-IL6-IFNα 和對(duì)照質(zhì)粒pET32a 的單菌落，接種于3 ml LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中，過(guò)夜培養(yǎng)12.0 h。將含有pET32a-IL6-IFNα 質(zhì)粒的培養(yǎng)液按1∶ 50 轉(zhuǎn)接于8管含有5 ml LB 液體培養(yǎng)基(Amp+)的玻璃試管中擴(kuò)大培養(yǎng)，約2.5 h 后測(cè)定OD 值。OD 值達(dá)到0.5 ～0.8 的重組質(zhì)粒分別加入濃度為0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、1.00 mmol/L、1.50 mmol/L、2.00 mmol/L、2.50 mmol/L和3.00 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)6.0 h，以此來(lái)確定誘導(dǎo)目的蛋白的最適IPTG 濃度。

1.8.2 不同時(shí)間誘導(dǎo)pET32-IL6-IFNα 重組質(zhì)粒篩選出最適IPTG 終濃度后，重復(fù)上述培養(yǎng)步驟，收集最佳IPTG 終濃度誘導(dǎo)的pET32α-IL6-IFNα/Rosetta(DE3)菌液分別誘導(dǎo)0 h、3.5 h、7.0 h，以此來(lái)確定誘導(dǎo)目的蛋白的最適時(shí)間。

1.8.3 pET32α-IL6-IFNα 蛋白的可溶性鑒定 利用超聲波裂解法裂解經(jīng)最佳IPTG 終濃度和最適誘導(dǎo)時(shí)間的pET32α-IL6-IFNα/Rosetta(DE3)，分出上清和沉淀，以此來(lái)確定目的蛋白的可溶性。

1.8.4 pET32α-IL6-IFNα 融合蛋白表達(dá)的檢測(cè)分別取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液1 ml，12 000 r/min離心5 min，棄上清后加入100 μl 1 ×SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水浴5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清15 μl 進(jìn)行15% SDS-PAGE 電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 IL6 基因和IFNα 基因編碼區(qū)序列的PCR 擴(kuò)增

利用IL6-F1/R1 和IFNα-F1/R1 分別擴(kuò)增出IL6 和IFNα 完全編碼序列，包含部分側(cè)翼序列，其中IL6 基因擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為669 bp，IFNα 基因擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為680 bp(圖1)。

2.2 IL6 和IFNα 成熟肽片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以質(zhì)粒pMD18-IL6 和pMD18-IFNα 為模板，分別用引物IL6-F2/R2 和IFNα-F2/R2 擴(kuò)增，獲得的PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)了與預(yù)期相符的片段，大小分別為591 bp 和541 bp(圖2)，測(cè)序結(jié)果與原序列一致。

圖1 IFNα 和IL6 基因編碼區(qū)的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the IFNα and IL6 coding sequences

圖2 IFNα 和IL6 成熟肽基因的PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of the IFNα and IL6 mature peptide genes

2.3 pMD18-IL6 和pMD18-IFNα 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

圖3、圖4 顯示IL6 和IFNα 信號(hào)肽序列均已去除，起始密碼子ATG 和Linker 序列添加成功。

2.4 pET32a-IL6-IFNα重組質(zhì)粒的PCR、酶切及測(cè)序

圖3 pMD18-IL6 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identifications of recombinant plasmid pMD18-IL6 by enzyme digestion

以pET32a-IL6-IFNα 為模板進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增片段大小約1 000 bp(圖5)，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，可得到大小約1 000 bp 和3 700 bp 的兩個(gè)片段，一條是IL6-IFNα 融合基因，一條是pET32a 質(zhì)粒載體(圖5)，結(jié)果與預(yù)期大小相符。將經(jīng)酶切和質(zhì)粒PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果與參考序列的氨基酸序列100%同源，重組質(zhì)粒閱讀框也正確，表明重組質(zhì)粒pET32a-IL6-IFNα 構(gòu)建成功。

2.5 pET32a-IL6-IFNα 在Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 結(jié)果

圖4 pMD18-IFNα 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pMD18-IFNα by enzyme digestion

圖5 重組質(zhì)粒pET32a-IL6-IFNα 的PCR 和酶切鑒定Fig.5 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pET32a-IL6-IFNα

收集1 ml 不同IPTG 終濃度誘導(dǎo)6.0 h 的pET32a-IL6-IFNα 和 對(duì) 照pET32a 菌 液，經(jīng)SDSPAGE 電泳，顯示重組目的蛋白分子量約44 960，其中IL6-IFNα 蛋白的分子量為42 270，載體序列翻譯的蛋白分子量為2 690，與預(yù)期大小相符合(圖6)。對(duì)電泳條帶經(jīng)灰度掃描后可知，1.00 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的產(chǎn)量最大。1.00 mmol/L IPTG 時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7.0 h 表達(dá)量最大(圖7)?？扇苄苑治鲲@示，重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。

3 討論

圖6 不同濃度IPTG 誘導(dǎo)6.0 h 表達(dá)的融合蛋白pET32a-IL6-IFNα/RosettaFig.6 Expression of the fusion protein after 6.0-h induction with different concentrations of IPTG

圖7 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)不同時(shí)間后表達(dá)的融合蛋白及蛋白的可溶性Fig.7 Expression level of the fusion protein after induction by IPTG for different time and its solubility

IL6 是機(jī)體中重要的免疫調(diào)節(jié)因子，由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠刺激B 細(xì)胞分化和Ig 產(chǎn)生，亦能刺激外周T 細(xì)胞和胸腺T 細(xì)胞成熟分化為細(xì)胞毒型T 細(xì)胞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、活化、分化、增殖和免疫等方面發(fā)揮著重要作用［12］。豬IL6 基因定位在豬9 號(hào)染色體上，在使用豬胰腺細(xì)胞作為異種移植治療I 型糖尿病的供體來(lái)源時(shí)，IL6 的應(yīng)用能夠防止促炎癥性細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)的死亡，延長(zhǎng)移植胰腺細(xì)胞存活時(shí)間［13］。IFNα是具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞增殖以及免疫調(diào)節(jié)的小分子量糖蛋白，已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，如黑色素瘤、T 細(xì)胞白血病、慢性丙型肝炎、乙型肝炎等［14-15］。豬IFNα 基因定位在豬1 號(hào)染色體上，無(wú)內(nèi)含子。由于病毒性疾病一直困擾著中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此在養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)中需要豬干擾素類(lèi)廣譜抗病毒生物制劑來(lái)治療和加強(qiáng)疫苗的免疫效果。可以推斷同時(shí)具有兩者生物功能的免疫試劑，將有可能大大提高抗病毒效果。

我們?cè)跇?gòu)建表達(dá)載體時(shí)，考慮到信號(hào)肽序列含有較多的疏水性氨基酸殘基，不利于其表達(dá)，且真核生物的信號(hào)肽在原核生物中進(jìn)行表達(dá)時(shí)大部分不具有分泌功能，將其去除不影響蛋白的正常功能，且去除信號(hào)肽后，復(fù)性蛋白穩(wěn)定性較好，因此我們?nèi)コ薎L6 和IFNα 的信號(hào)肽序列(分別是前28 個(gè)和前23個(gè)氨基酸)。鑒于甄洪花［9］等發(fā)現(xiàn)IL6 和其他基因單獨(dú)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因，所以將IL6 基因設(shè)計(jì)在離啟動(dòng)子近的位置上，以促進(jìn)融合蛋白的成功表達(dá)。有關(guān)Linker 的選擇上，我們?cè)趨⒖枷嚓P(guān)文獻(xiàn)［10，13，16］的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，最后選用了一段親水性、低電荷效應(yīng)的氨基酸將兩個(gè)分子進(jìn)行連接，即在IL6 和IFNα 之間加入了一段由9 個(gè)氨基酸組成的柔性L(fǎng)inker，其中IL6 加入了G4S (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，IFNα 加入了GSGG (Gly-Ser-Gly-Gly)。我們還用SOPMA 程序分析其串聯(lián)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)出兩分子并未發(fā)生相互干擾折疊，但是否能夠得到具有雙重活性的蛋白還需要進(jìn)一步研究。

本研究是以大腸桿菌Rosetta(DE3)作為表達(dá)宿主菌，T7 RNA 聚合酶的序列整合在該菌株染色體上，T7 聚合酶可以與T7 強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)合，啟始轉(zhuǎn)錄;另外其還攜帶了大腸桿菌6 種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA的基因質(zhì)粒，這提高了外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。為了構(gòu)建與之相應(yīng)的原核表達(dá)重組載體，我們選用了具有強(qiáng)大表達(dá)重組蛋白功能的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a 作為載體，其轉(zhuǎn)錄和翻譯受控于噬菌體T7 強(qiáng)啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(rbs)，翻譯的蛋白常帶有6 個(gè)組氨酸(6 ×His)標(biāo)簽，有利于以后鑒定和純化目的蛋白。

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