楊北寧， 張鳳芝， 蘇國興

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

迄今為止，已有大量有關(guān)一氧化氮(NO)促進植物種子萌發(fā)的報道［1］。Kopyra等在羽扇豆(Lupinus luteus)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)可提高種子萌發(fā)率，作用效果與時間有關(guān)，48 h后SNP這種促進萌發(fā)作用消失［2］。Lamatine等報道，在26℃條件下，SNP能夠明顯地促進處于暗處的萵苣種子萌發(fā)，而用NO清除劑cPTIO處理則可降低對萌發(fā)的促進作用［3］。外源添加一定濃度SNP可明顯提高豌豆、黃瓜、玉米和刺槐種子的發(fā)芽率［4］。Sarath等證實，NO供體SNP、亞鐵氰化鉀和CN－同樣可促進2種溫季牧草種子的萌發(fā)，并可被NO清除劑cPTIO抑制，而認定在該種子萌發(fā)過程中有NO的產(chǎn)生［5］。近年來，隨著NO在植物種子萌發(fā)和休眠中所起作用的確定，人們相繼展開了NO促進種子萌發(fā)和解除休眠的機理研究。如在擬南芥種子萌發(fā)過程中，證實NO的作用部位是糊粉層。在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中，發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進［6］。然而，經(jīng)NO和NO合成抑制劑處理后，在種子萌發(fā)過程中，種子內(nèi)貯藏物質(zhì)含量的變化仍鮮見報道。本研究以萵苣種子為材料，研究NO供體硝普鈉(SNP)和NO生物合成抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對萵苣種子萌發(fā)時內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性的影響，為NO供體促進萵苣種子萌發(fā)時物質(zhì)代謝變化的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

萵苣(Lactuca sativa L.)品種掛絲紅種子購于四川省綿陽市種都種業(yè)有限公司。所有藥品均購自Sigma公司。

萵苣種子先用0.5%的HgCl2消毒5 min，再用無菌水沖洗5次后，在22℃黑暗環(huán)境中用處理液浸種4 h，處理液濃度如下:(1)0 mmol/L(對照)、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L NO 供體 SNP;(2)1.00 mmol/L NO生物合成抑制劑L-NAME，所有處理液pH 5.8。選取飽滿的種子播種于含0.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)。每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.2 測定方法

用目測法(胚根突破種皮大于1 mm)測定0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L SNP處理48 h萵苣種子的萌發(fā)率及0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP和1.00 mmol/L L-NAME分別處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 萵苣種子的種子萌發(fā)率。測定0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP 和 1.00 mmol/L LNAME 分別處理12 h、24 h、36 h、48 h 萵苣種子內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性:粗脂肪索氏提取法測定粗脂肪含量［7］;蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量［8］;考馬斯亮藍 G250 法測定蛋白質(zhì)含量［8］;3，5-二硝基水楊酸比色法測定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性［8］;堿式滴定法測定脂肪酶活性［9］;磺胺法測定硝酸還原酶活性［10］。

1.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用Duncan’s法比較差異顯著性。應(yīng)用EXCEL軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度硝普鈉(SNP)對萵苣種子萌發(fā)的影響

用不同濃度SNP處理萵苣種子36 h，種子的萌發(fā)率如圖1所示。SNP對萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進作用，在0～0.10 mmol/L濃度范圍內(nèi)，種子萌發(fā)率隨SNP濃度的增加而升高，當(dāng)SNP濃度為0.10 mmol/L時，種子萌發(fā)率最高;而當(dāng)SNP的濃度增至0.20 mmol/L時，種子萌發(fā)受到明顯抑制。表明0.10 mmol/L SNP促進萵苣種子萌發(fā)的效果最佳。

圖1 不同濃度硝普鈉對萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of SNP on the seed germination of lettuce

2.2 0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)和1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對萵苣種子萌發(fā)的影響

在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP處理對種子萌發(fā)的促進作用最為顯著，在浸種處理24 h和36 h時，種子萌發(fā)率分別比對照增加26.5個百分點(P＜0.05)和15.5個百分點(P＜0.05)，但浸種處理48 h后這種促進作用逐漸減弱。1.00 mmol/L LNAME浸種則可顯著抑制種子的萌發(fā)，在浸種36 h時，萌發(fā)率僅28.1%(圖2)。

圖2 0.10 mmol/L 硝普鈉和 1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯對萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.2 The effect of 0.10 mmol/L SNP and 1.00 mmol/L LNAME on the seed germination of lettuce

2.3 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)對萵苣種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響

如表1所示，0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量均隨著處理時間的延長而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對照)相比，差異均不顯著(P＞0.05));0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時間的延長而逐漸增加，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05)。

表1 0.10 mmol/L SNP對萵苣種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 1 The effects of 0.10 mmol/L SNP on some substance contents of lettuce during seed germination

如表2所示，1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的蛋白質(zhì)含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對照)相比，差異均不顯著(P＞0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的粗脂肪含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，處理36 h和48 h的粗脂肪含量均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時間的延長而逐漸增加，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05)。

表2 1.00 mmol/L L-NAME對萵苣種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 2 The effects of 1.00 mmol/L L-NAME on some substance contents during lettuce seed germination

2.4 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)處理后部分水解酶活性的變化

如圖3所示，不同處理下萵苣種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，其中0.10 mmol/L SNP處理的α-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0 mmol/L SNP處理下β-淀粉酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理36 h時β-淀粉酶活性均達到最高峰，0.10 mmol/L SNP處理的β-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過程中脂肪水解酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，在浸種12～48 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子脂肪水解酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對照)處理(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過程中硝酸還原酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，在浸種12～36 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子硝酸還原酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對照)處理(P＜0.05)。在浸種12～36 h 1.00 mmol/L L-NAME處理的 α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶、硝酸還原酶的活性均顯著低于0 mmol/L SNP(對照)和0.10 mmol/L SNP處理(P ＜0.05)。

圖3 萵苣種子萌發(fā)過程中部分水解酶活性的變化Fig.3 The changes of some hydrolases activities during seed germination of lettuce

3 討論

一氧化氮在植物體的多種生理過程中有重要作用。從本試驗結(jié)果來看，0 mmol/L、0.05 mmol/L和0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)對萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進作用，其中0.10 mmol/L硝普鈉的促進作用好于其他2種處理，當(dāng)SNP濃度上升到0.20 mmol/L時種子萌發(fā)受到顯著抑制;在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP對種子萌發(fā)的促進作用最為顯著，48 h后作用消失。這與白旭等［10］關(guān)于SNP促進萵苣種子萌發(fā)的研究結(jié)果相一致。

Bethke等指出，NO促進種子的萌發(fā)可能與種子對脫落酸和赤霉素的敏感性改變有關(guān)［11］，而ABA和GA與種子水解酶的誘導(dǎo)合成和活性調(diào)節(jié)有關(guān)。孫永剛等在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中，發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進［12］，這暗示在種子萌發(fā)過程中，種子內(nèi)含物質(zhì)的變化會受到NO的影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP浸種，雖可對種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的下降有一定的促進作用，但效果不顯著;而0.10 mmol/LSNP浸種可顯著降低淀粉和增加可溶性糖含量。用抑制種子萌發(fā)的NO生物合成抑制劑1.00 mmol/L L-NAME浸種，同樣發(fā)現(xiàn)，它們對淀粉降解的抑制作用非常明顯，12 h后便觀察到可溶性糖含量的顯著下降，而1.00 mmol/L L-NAME對種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的影響不大。這些結(jié)果與孫永剛等［12］的結(jié)果相符。

種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化一般與種子內(nèi)水解酶活性的變化相對應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP處理可顯著增加α-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪水解酶活性;β-淀粉酶活性雖在處理36 h時后呈逐漸下降趨勢，但前期(12～36 h)也明顯受SNP促進。而用1.00 mmol/L L-NAME浸種，種子的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶和硝酸還原酶活性均受到抑制。這些結(jié)果暗示，NO可能通過調(diào)節(jié)α-淀粉酶、β-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪酶等水解酶的活性，影響種子體內(nèi)貯藏物質(zhì)的降解，進而影響萵苣種子萌發(fā)，其中，對淀粉降解和可溶性糖增加的促進作用最為明顯。

［1］張愛慧，朱士農(nóng).外源一氧化氮對不同貯藏年限甘藍、黃瓜種子萌發(fā)活力的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3):109-111.

［2］KOPYRA M，GWOZDZ E A.Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of lupinusluteus［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2003，41:1011-1017.

［3］LAMATINA L，BELIGI M V，GARCIA M C.Method of enhancing the metabolic function and the growing conditions of plants and seeds［J］.United State Patent，2001，6:242-384.

［4］周永斌，殷 有，蘇寶玲，等.外源一氧化氮供體對幾種植物種子的萌發(fā)和幼苗生長的影響［J］.植物生理學(xué)通訊，2005，46(3):21-27.

［5］SARATH G，BETHKE P C，JONES R，et al.Nitric oxide accelerates seed germination in warm-season grasses ［J］.Planta，2006，223:1154-1164.

［6］趙福庚，劉友良.高等植物體內(nèi)特殊形態(tài)多胺的代謝及調(diào)節(jié)［J］.植物生理學(xué)通訊，2000，36(1):1-6

［7］張志良.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.2版.北京:人民教育出版社，1990.

［8］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［9］黃學(xué)林，陳潤政.種子生理試驗手冊［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［10］白 旭，蘇國興，孫 娜，等.外源多胺對萵苣種子萌發(fā)誘導(dǎo)效應(yīng)及其與一氧化氮的關(guān)系［J］.西北植物學(xué)報，2009，29(9):1860-1866.

［11］BETHKE P C，LIBOURELI G L，AOYAMA N，et al.The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide，gibberellin，and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy［J］.Plant Physiology，2007，143:1173-1188.

［12］孫永剛，凌騰芳，王家杰，等.外源一氧化氮供體硝普鈉對小麥種子萌發(fā)早期淀粉酶及其亞細胞分布的影響［J］.作物學(xué)報，2008，34(9):1608-1614.